大鼠骶上不同節段脊髓損傷后神經源性膀胱模型比較及尿流動力學分析

卓 越，許 明，鄧石峰，劉 瓊，彭嘉穎，唐麗亞，艾 坤*，張 泓*

（湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208）

近年來，我國脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)的發病率日趨升高[1-2]。 神經源性膀胱(neurogenic bladder, NB)是SCI 后常見的泌尿系并發癥，嚴重危害到患者遠期生存率及終身生活質量[3]。 臨床上，超過80%的SCI 患者均屬于骶上脊髓損傷(supersacral spinal cord injury, SSCI)[4]。 根據尿道括約肌協同與否，SSCI 后的NB 可表現為逼尿肌反射亢進和逼尿肌-括約肌協同失調兩種主要類型，從而呈現以尿失禁為主或以尿潴留為主的兩種截然不同的癥狀表現，其治療方案與研究側重點也有所差別[5]。

動物實驗研究依賴于穩定動物模型的建立，大鼠因其與人類生理病理情況高度相似且成本低廉、易于處理，成為目前SCI 后NB 的主要實驗動物[6]。在既往工作中，本團隊總結探索出了一套改良Hassan Shaker 脊髓完全性橫斷法，并分別建立了骶上與骶髓損傷后不同類型NB 大鼠模型[7-8]，且一直致力于研究電針治療該類疾病的療效及其作用機制，已取得部分成果[9-11]；國內相關學者亦對骶上與骶髓損傷后NB 進行了較全面的比較與探索[12-13]。 然而，隨著研究逐漸深入發現，關于不同節段SSCI 導致兩種不同類型NB 大鼠模型的系統性對比分析尚少，故亟須對該問題進行探索研究。

膀胱儲排尿功能受到高位腦橋-皮質排尿中樞和低位脊髓交感-副交感排尿中樞協同支配，根據不同節段SSCI 與脊髓交感-副交感排尿中樞的位置關系以及大鼠脊髓節段與椎骨解剖學對應范圍，本研究選擇第8 胸椎下（約對應T10 脊髓節段）和第10 胸椎下（約對應L1 脊髓節段）[14-15]脊髓完全性橫斷致NB 大鼠為模型，通過觀察每日手法排尿量及尿流動力學檢測，對比分析上述兩種不同節段SSCI后NB 的不同表現，驗證其與兩類NB 之間的關系，以期為該領域科研實驗動物模型的選擇提供一定的科學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF 級成年SD 雌性大鼠48 只（根據前期預實驗中約70%以上的成模率計算得出），體質量250～280 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供與飼養[許可證號：SYXK(湘)2019-0004]。 動物在溫度24～26 ℃、濕度50%～70%、12 h∶12 h 明暗交替、食水自取的條件下，適應性喂養1 周后進行分組。 首先，按隨機數字表法從48 只大鼠中抽取12 只作為假手術組，剩下的36 只大鼠再隨機分為模型1 組（第8 胸椎下脊髓橫斷）和模型2 組（第10 胸椎下脊髓橫斷），每組18 只。 本研究中實驗動物條件符合《實驗動物管理條例》要求，且實驗過程中對動物的處置嚴格依照《關于善待實驗動物的指導性意見》執行。 本實驗方案已獲得湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理編號：LL2021091504）。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，100 mL，批號：R510-22)；生理鹽水（哈藥集團有限公司，300 mL，批號：C22010509）；青霉素鈉（哈藥集團有限公司，80 萬U/支，批號：220106）；乳酸鈉林格注射液（安徽環球藥業股份有限公司，500 mL，批號：20211218-2）；5%葡萄糖注射液（貴州天地藥業有限公司，500 mL，批號：20080802）；苦蘋果防舔防咬噴劑（美國Grannick公司，236 mL）；乳果糖口服溶液（荷蘭Abbott Biologicals B.V.公司，15 mL/袋，批號：H20171057）；醫用石蠟油（黑龍江省運加醫療科技有限公司，10 mL/支，批號：黑械注準2019214009）。 導尿管（上海上醫康鴿醫用器材有限責任公司，型號：F3）；MP-150 多通道生理記錄儀（美國BIOPAC 公司，型號：MP150-WSW）；微量注射泵（浙江史密斯醫學儀器有限公司，型號：WZ-50C6）。

1.3 造模方法及術后管理

1.3.1 造模方法 以Hassan Shaker 脊髓橫斷法[16]為基礎，結合本團隊前期經驗[7-8]以及本研究中提出的優化改良法進行骶上不同節段（第8 胸椎下/第10 胸椎下）脊髓完全性橫斷致NB 大鼠模型制備。具體如下：術前1 d，大鼠禁食不禁水；術前2 h，腹腔注射20 萬U 青霉素鈉預防術中及術后感染；使用3%～4%異氟烷誘導大鼠進入麻醉狀態，待其夾尾反射和角膜反射消失后行俯臥位溫和固定，然后調整麻醉濃度為2%～2.5%以維持術中麻醉狀態，隨后進行手術定位、備皮、鋪巾、消毒；從大鼠頭骨后正中線向下沿脊柱棘突觸摸到的第1 個明顯豎長突起處為第2 胸椎棘突，繼續沿此方向觸摸到第2 個中立位寬大突出處即為第10 胸椎棘突，以此為骨性標志再向上順摸2 個錐體棘突即可定位第8 胸椎（見圖1），本次實驗中脊髓橫斷處分別為第8 胸椎下和第10 胸椎下； 沿T8/T9 或T10/T11 錐體棘突縱向切開皮膚及皮下筋膜2～3 cm 后，使用玻璃分針鈍性分離棘突與椎板兩側肌肉，暴露T8/T9 或T10/T11 錐體棘突及相鄰椎弓，用顯微咬骨器從尾側向頭側咬開T8或T10 椎板及兩側椎弓根， 直至椎管內脊髓充分暴露；將牙科彎鉤平頭輕穿過脊髓腹后部，用眼科剪以垂直方向沿彎鉤平頭整齊迅速地橫斷脊髓，并確認無神經纖維殘留；確認大鼠生命體征無異常后，進行創口清理與逐層縫合。 假手術組大鼠僅切開并暴露T8 至T10 節段棘突與相鄰椎弓后立即縫合。

圖1 大鼠骨性標志定位

1.3.2 術后管理 （1）存活管理：術后立即將大鼠平送至電熱毯上，以頭尾四肢伸展俯臥位進行復溫，并使用肛溫計檢測體溫變化；待其蘇醒及生命體征平穩后轉至單籠飼養，保持籠內墊料干燥蓬松。 （2）喂養管理：術后當天僅予以10 mL 5%葡萄糖注射液對口滴食以補充能量，減輕消化及泌尿系統負擔；術后第2～3 天，開始逐漸輔以少量固體飼料喂養（小于20 g）；術后第4 天開始，恢復常規固體飼料喂養。（3）并發癥管理：術后第1～3 天，每隔12 h 皮下注射乳酸鈉林格注射液（20 mL/kg）以防止酸堿失衡和電解質紊亂，每隔12 h 腹腔注射青霉素鈉（20 萬U/只）以抗感染和減輕膿血尿；術后第4～7 天，停用乳酸鈉林格注射液，青霉素鈉改為每24 h 使用1次；術后第8 天停用青霉素鈉，僅在有明顯感染癥狀時對癥使用；另外，術后至創口完全結痂前，每日均使用聚維酮碘消毒創口及周圍5 cm 皮膚，并用50%乙醇溶液擦拭大鼠腹部及雙下肢以防止壓瘡； 每日于大鼠后肢噴涂苦蘋果噴霧以預防大鼠啃食自殘。 （4）二便管理：術后第1 天開始，每隔8 h(即每日6:00、14:00、22:00)用Crede 法[7-8]人工輔助大鼠排尿；每次排尿結束后予以順時針手法按摩大鼠下腹部10 min，以促進排便和預防腸梗阻；對于術后已經出現明顯便秘及腹脹的大鼠，予以乳果糖灌胃2 mL/d，嚴重時配合醫用石蠟油灌腸后揉腹導便。

1.4 模型評估

結合本團隊前期觀察以及國內外相關研究，本實驗模型評估標準如下。

1.4.1 脊髓休克期及成模時間評估 造模術后大鼠會立即進入脊髓休克期，該期間動物生命體征及模型表征尚不穩定，故需待脊髓休克期結束后才可出現穩定性高的動物模型。本團隊前期研究已經明確，SSCI 致NB 模型大鼠在術后1 周左右度過脊髓休克期[8]，穩定成模時間約為術后第18 天[7]，故本研究在大鼠術后第19 天予以尿流動力學檢測。

1.4.2 后肢運動功能評估 造模術后至脊髓休克期內大鼠后肢運動功能應完全性喪失，在前肢行走時后肢處于拖動狀態。 具體而言，由同一人采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分進行評估，即將大鼠放入籠盒之中，輕敲籠壁促其移動，并觀察其軀干和臀、膝、踝、足等關節活動及協調情況，評分范圍為0～21 分，0 分為雙后肢活動不可見，分數越高代表活動越正常[17]。 本研究中，大鼠術后BBB 評分應為0分；反之，則予以剔除。

1.4.3 膀胱肉眼形態及功能評估 造模術后至脊髓休克期內，大鼠膀胱功能處于無反射期，自主排尿困難，尿潴留及膀胱脹大明顯，需手法輔助排尿；而脊髓休克期結束后，骶上不同節段脊髓損傷大鼠膀胱形態及功能會出現明顯差異。 具體而言，多數第8胸椎下脊髓橫斷大鼠膀胱脹大情況較脊髓休克期時減輕，但仍呈“橄欖”狀脹大，不能恢復自主排尿，僅偶有下腹部及籠內墊料潮濕，呈尿潴留為主的癥狀表現；而多數第10 胸椎下脊髓橫斷大鼠膀胱脹大情況較脊髓休克期時明顯減輕，出現反射性排尿或漏尿明顯，且其下腹部及籠內墊料經常性潮濕，呈尿失禁為主的癥狀表現[7-8]。

1.4.4 其他評估 造模術后至整個實驗過程中，若大鼠出現死亡或恢復正常排尿功能以及出現明顯自殘、反復嚴重膿血尿、難以愈合性壓瘡等不良事件[7-8]，則及時記錄并予以剔除。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般情況 觀察各組大鼠術后生存率及成模率情況，記錄期間不良事件情況及處理方式和處理結果。

1.5.2 每日手法排尿量 比較兩個模型組大鼠每日手法排尿（見圖2）的尿量變化情況，即造模術后第1～18 天大鼠每日3 次（6:00、14:00、22:00）用Crede法排出尿量的總和(均由同一人操作與記錄)。

圖2 每日手法排尿

1.5.3 尿流動力學 使用膀胱造瘺法進行測量，先用異氟烷（使用方式及參數設置同造模時）麻醉大鼠后行仰臥位固定，輕柔手法盡量排空膀胱內尿液后，行下腹部備皮與消毒。 隨后經三通管將MP-150 的測壓管與微量注射泵、F3 導尿管相連接，并準備好溫度為25～35 ℃的生理鹽水，設置6.0 mL/h 的速度準備膀胱灌注。 將F3 導尿管先平放于膀胱水平以設置MP-150 壓力模塊基線值，然后沿大鼠前正中線恥骨聯合上1 cm 處縱向切開2 cm 并暴露膀胱，于膀胱穹窿處用眼科剪剪開小口后，插入F3 導管至膀胱體內正中，用2-0 手術線捆綁導管與膀胱開口處，確認無滲漏后用10 mL 注射器連接三通管空頭將膀胱內殘余尿吸出并記錄為“殘余尿量”。 靜置30 min 后，開始灌注并電腦同步記錄膀胱壓力曲線情況。 重點觀察大鼠尿道口首次液體流出時的膀胱內壓，即“漏尿點壓力”，以及此刻的灌注量，即“膀胱最大容量”。 待漏尿點出現后繼續灌注出4～5 個穩定波形后結束檢測，記錄膀胱內壓峰值，即“膀胱最大壓力”[7，9]。

1.6 統計學方法

使用SPSS 23.0 軟件進行數據統計分析，本研究中實驗結果以“±s”形式表示。計量資料若符合正態分布且方差齊，兩組比較使用兩樣本均數t 檢驗；三組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用邦弗倫尼檢驗；方差不齊時使用塔姆黑尼檢驗；不符合正態分布時采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

2.1.1 假手術組 12 只大鼠生命體征穩定，無不良事件發生，存活率為100%。

2.1.2 模型1 組 18 只大鼠造模術后：1 只失血過多死亡；4 只大鼠出現便秘及腹脹，對癥處理后3 只存活、1 只死亡（見圖3）；1 只大鼠因左下肢啃食自殘后嚴重感染死亡。 該組大鼠最終存活15 只，經模型評估13 只大鼠呈尿潴留為主要癥狀的NB 合格模型，故模型1 組存活率為83.3%、成模率為72.2%。 詳見表1。

2.1.3 模型2 組 18 只大鼠造模術后：1 只因體溫過低死亡；4 只大鼠先后出現膿血尿，抗炎處理后3只痊愈，1 只因膿腎死亡（見圖4）。 該組大鼠最終存活16 只，經模型評估14 只大鼠呈尿失禁為主要癥狀的NB 合格模型，故模型2 組存活率為88.9%，成模率為77.8%。 詳見表1。

圖3 腸道脹滿及膀胱尿潴留明顯

圖4 尿液反流及泌尿系感染導致膿腎

2.2 每日手法排尿量比較

記錄模型1 組及模型2 組大鼠每日3 次手法排尿總量后發現：兩組大鼠手法排尿量在術后第4～5天達到峰值，隨后緩慢下降；術后第7～8 天，兩組大鼠手法排尿量明顯下降；隨后，模型1 組手法排尿量呈平穩下降趨勢，并于術后第16～18 天趨于穩定，而模型2 組手法排尿量呈快速下降趨勢，也于術后第16～18 天趨于穩定。 詳見圖5。

對模型1 組及模型2 組大鼠每日手法排尿量進行統計分析后發現：兩組大鼠術后前7 日手法排尿量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；從術后第8 天開始，模型1 組大鼠手法排尿量明顯多于模型2 組，兩組差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。 詳見圖6。

圖5 兩組模型大鼠術后第1～18 天每日手法排尿量情況

圖6 術后第1～18 天每日手法排尿量比較(±s，模型1 組n=13，模型2 組n=14)

表1 各組大鼠術后一般情況

2.3 尿流動力學比較

與假手術組和模型2 組比較，模型1 組膀胱最大容量及殘余尿量增多，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01），而模型2 組膀胱最大容量小于假手術組,差異有顯著統計學意義（P＜0.01），模型2 組較假手術組殘余尿量有增多趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與假手術組比，模型1 組和模型2 組漏尿點壓力和膀胱最大壓力均升高，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01），模型1 組漏尿點壓力有高于模型2 組的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），模型1 組膀胱最大壓力較模型2 組更大，差異有統計學意義（P＜0.05）。 詳見圖7。

3 討論

本研究結果提示，第8 胸椎下脊髓橫斷所致NB以逼尿肌-括約肌協同失調為主要類型，膀胱容量增大、排尿困難、殘余尿增多，尿潴留是其主要特征；而第10 胸椎下脊髓橫斷所致NB 以逼尿肌反射亢進為主要類型，膀胱容量相對變小、儲尿困難、殘尿量部分存在、尿失禁是其主要特征。完整的排尿周期分為儲尿期和排尿期兩個階段，正常膀胱儲排尿功能受中樞神經系統與外周神經系統的協同支配，即在高位腦橋-皮質排尿中樞的控制下， 通過協調低位脊髓交感-副交感排尿中樞，調節脊髓交感、副交感神經核及Onuf's 核的活動使支配膀胱的外周神經協同的生理過程[14]。具體而言，膀胱外周神經支配主要包括腹下神經、盆神經及陰部神經。腹下神經屬交感神經，主要支配尿道內括約肌（膀胱頸、后尿道）及其興奮性收縮，實現儲尿期膀胱內低壓和儲尿；盆神經屬副交感神經，主要支配膀胱逼尿肌及其興奮性收縮，實現排尿期膀胱內壓上升直至尿液排出；而陰部神經屬軀體神經，主要支配尿道外括約肌，可在高位皮質排尿中樞的協調下主觀性輔助控制膀胱儲排尿功能。

大鼠膀胱神經支配結構與人類相似，但其核團位置相對靠下，大鼠腹下神經出自L1～L2 脊髓節段，大致對應其T10～T12 椎體范圍；盆神經和陰部神經出自L6～S1 脊髓節段，大致對應L1～L2 椎體范圍[14-15，18]。本研究中，第8 胸椎下脊髓橫斷造成的脊髓直接及繼發性損傷集中在T10 上下脊髓平面，此時高位排尿中樞對低位脊髓交感-副交感排尿中樞的協調性支配嚴重損害，出現高反射逼尿肌與高反射括約肌，即逼尿肌-括約肌協同失調[19]。第8 胸椎下脊髓橫斷造成NB 的病理本質為逼尿肌無抑制性收縮過程中括約肌間斷或持續性舒張不能，其膀胱內壓增大，但由于膀胱頸處括約肌梗阻，導致排尿困難，殘余尿增多，呈以尿潴留為主的癥狀表現，而大量殘余尿及長期尿潴留則會進一步引起膀胱容量的增大。 故尿流動力學可見其膀胱最大容量及殘余尿量明顯上升，膀胱最大壓力及漏尿點壓力顯著升高。第10 胸椎下脊髓橫斷造成的直接及繼發性損傷主要累及L1 上下脊髓平面，該損傷平面相對偏下，使得高位排尿中樞對脊髓交感排尿中樞的協同性控制得到一定程度保留，逼尿肌-括約肌協調情況相對較好，病理本質以脊髓副交感排尿中樞過度興奮導致的逼尿肌反射亢進為主。 故該類NB 最大壓力及漏尿點壓力仍增高，但程度較前組輕，其以儲尿困難、膀胱容量相對變小為特征，并呈現出尿失禁為主的癥狀表現[20]，該組尿流動力學結果亦符合以上特征。 值得注意的是，本研究中雖然模型2 組殘余尿量與假手術組差異并無統計學意義，但考慮其膀胱容量相對縮小，依然可以認為其有部分殘余尿存在，這也與臨床實際情況相符合[21]。

圖7 各組大鼠尿流動力學指標比較(±s，假手術組n=12，模型1 組n=13，模型2 組n=14)

SSCI 后，大鼠會首先進入脊髓休克期，即與高位中樞分離后，橫斷平面以下脊髓所支配的內臟和軀體反射、運動和感覺功能均明顯減退甚至消失,該時期可持續數小時至數周不等，通常脊髓損傷平面越高，脊髓休克期越長[22]。本團隊前期研究中已發現SSCI 模型大鼠脊髓休克期為期1 周左右[8]，本研究中也發現兩組SSCI 模型大鼠的每日手法排尿量均在術后第4～5 天到達頂峰，這是由于此時膀胱功能處于無反射期，逼尿肌及括約肌松弛癱瘓，無法有效排出尿液，出現代償性尿潴留狀態，故需依靠手法輔助排出大量尿液。 臨床而言，留置導尿管也是患者該時期的首選方案[23]。在術后第7～8 天，兩模型組大鼠每日手法排尿量明顯下降，說明此時膀胱收縮功能開始恢復，基本脫離脊髓休克期。 但由于高、低位排尿中樞間聯系受阻，逼尿肌會出現持續性無抑制性收縮，即逼尿肌反射亢進[24]，此時大鼠呈現反射性排尿模式，故術后第2 周開始，兩組SSCI 模型大鼠每日手法排尿量均呈下降趨勢。

因此，從SSCI 后膀胱的神經源性及肌源性調控角度而言，本研究中兩種不同節段SSCI 所引起的NB 癥狀表現差異主要源于高位排尿中樞對低位脊髓交感排尿中樞調控的存廢，以及導致的逼尿肌-括約肌協同性問題[14]。 這亦可以解釋從術后第2 周開始，模型1 組大鼠每日排尿量下降趨勢平穩，并最終于術后第16～18 天穩定于尿潴留為主的病理狀態，而模型2 組大鼠每日排尿量下降趨勢迅速，并于術后第16～18 天穩定于尿失禁為主的病理狀態的深層機制。 同時，本研究還佐證了本團隊前期發現的SSCI 后NB 大鼠模型在術后第18 天左右趨于穩定的重要問題[7]，為后續該病動物實驗研究的開展奠定了良好的科學基礎。

NB 是SCI 后嚴重且難治性并發癥之一，此外，臨床上的SCI 患者還存在包括泌尿系感染、神經源性胃腸功能障礙、壓瘡等在內的一系列問題[23]，這些也在本研究的動物模型中得到較全面的展現，證明該模型制備法是可靠且貼合實際的。相應地，本研究為更好地關注膀胱功能，對術后存在膿血尿的泌尿系感染大鼠使用抗生素短期消炎處理，而反復感染的則予以剔除以免藥物影響實驗結果。 SCI 后胃腸道問題是該類動物模型死亡的重要因素，故本研究采用異氟烷吸入誘導大鼠麻醉，既滿足醫學動物倫理最新要求，也避免了既往水合氯醛所帶來的胃腸道刺激等副作用。同時，本研究對術后5 d 內大鼠先予以營養性液體再逐漸配合固體飼料的喂養順序，有效減輕了其術后胃腸道負擔，并針對已存在腹脹及便秘的大鼠予以每日摩腹的預防措施，效果不佳者予以滲透性瀉劑乳果糖灌胃配合潤滑性瀉劑石蠟油灌腸。對壓瘡及啃食自殘大鼠則予以及時護理和苦味劑噴涂處理等。 以上優化改良措施都進一步提高了動物術后存活率及成模率[7-8]。 此外，本研究結合術中觀察及相關文獻[25]后發現，大鼠脊椎上普遍存在易于體表定位的第2 胸椎棘突，而下方的第10 胸椎棘突高聳中立可觸及，且第9 胸椎及以上棘突方向朝尾側、第11～13 胸椎棘突朝頭側,易于術中辨認。故相較于以往浮肋連接定位第13 胸椎后再向上逐個推按的易于出錯且繁雜的定位方式，本研究中優化改良的手術定位方式，可以更快速精準地選定高位脊髓橫斷切口，縮短了手術時間，提高了造模效率。另外，本研究改用眼科平剪進行脊髓暴露后的橫斷，相比于刀片切割，其對神經纖維的橫斷更為快速徹底，且降低了大量出血的風險，也減小了手術創面。

綜上所述，本研究優化了SSCI 后NB 大鼠模型的制備及術后管理方案，提升了手術造模效率及術后動物存活率和成模率。 在此基礎上，結合膀胱儲排尿功能研究的金標準“尿流動力學”[26]分析后提出：第8 胸椎下脊髓橫斷所致NB 以逼尿肌-括約肌協同失調為主要類型，膀胱容量增大、排尿困難、殘余尿增多、尿潴留是其主要特征；第10 胸椎下脊髓橫斷所致NB 以逼尿肌反射亢進為主要類型，膀胱容量相對變小、儲尿困難、殘尿量部分存在、尿失禁是其主要特征。 高位排尿中樞對低位脊髓交感排尿中樞調控的存廢，導致逼尿肌-括約肌協同與否，是兩類NB 模型差異的重要原因。 該研究亦受制于樣本量偏小，動物個體差異難以控制，機制研究不夠深入以及模型觀察時間較短等限制，使得研究結果存在一定局限性，今后應結合動物平滑肌張力測定、神經電生理、分子生物學等技術手段進一步加強本研究結論的客觀全面性。