長鏈非編碼RNA ANO1-AS1對食管鱗癌細胞增殖及凋亡的影響

邵生輝，張 健，彭雅瓊，向 輝，趙 敏，謝元茂，鄭 勇，陳衛剛

目前，我國仍是食管癌發病率最高的國家[1]。食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是食管癌最常見的組織學亞型[2]。由于ESCC起病晚，缺乏早期疾病標志物，通常被診斷已為晚期，其總的5年生存率僅有20%左右[3]。研究[4-5]顯示，食管癌的發生發展與基因的表達失衡密切相關，因此，探尋與其相關的分子標志物，對食管癌的防治具有一定意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)因其轉錄本長度超過200個核苷酸且不編碼蛋白質而得名[6]。近年來，大量LncRNA被發現并證實參與腫瘤的多項生理和病理過程[7]。課題組前期通過基因芯片技術，發現食管鱗癌組織中有大量LncRNAs存在異常表達，其中鈣離子激活氯離子通道蛋白1反義RNA1 (anoctamin 1 antisense RNA-1，ANO1-AS1)在ESCC組織中表達上調[8]。目前ANO1-AS1在食管癌中的作用鮮有報道，為探究該基因在食管癌中所發揮的功能，該研究通過轉染沉默慢病毒下調食管癌細胞TE-1和EC109中ANO1-AS1的表達，觀察食管癌細胞增殖及凋亡等生物學功能的變化并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人食管鱗狀細胞癌細胞株(TE-1、EC109)由石河子大學醫學院新疆地方與民族高發病重點實驗室留存。

1.1.2主要試劑 沉默慢病毒由上海吉瑪制藥技術有限公司制備；胎牛血清購自以色列 BI公司；高糖DMEM培養基購自美國 Gibco公司；雙抗及胰蛋白酶購自美國 Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO)購自上海生物工程技術有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；引物均購自上海生工生物工程股份有限公司；qRT-PCR試劑盒購自德國QIAGEN公司；CCK-8試劑盒購自日本東仁公司；Bcl-2和Bax兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司；其他兔抗人多克隆抗體購自美國CST公司；小鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器 熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；酶聯免疫檢測儀、垂直電泳槽、電泳儀、電轉印儀均購自美國Bio-Rad公司；全自動化學發光成像儀購自上海天能科技有限公司；梯度PCR儀器購自日本Takara公司；實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2 細胞培養與轉染篩選細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養基在37 ℃、5%CO2、濕度95%的培養箱內進行培養。待細胞融合度達到80%～90%時進行傳代、凍存或功能實驗。細胞轉染所用沉默ANO1-AS1慢病毒載體和空載體濃縮液由上海吉瑪制藥技術有限公司制備完成。其中sh-ANO1-AS1序列為5′-GGAACCGGAATCAATCATTAT-3′，sh-NC序列為5′- TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。參照吉瑪基因慢病毒使用手冊進行慢病毒轉染，嘌呤霉素篩選后傳代保存穩轉株并進行下一步實驗。分組情況：sh-ANO1-AS1(實驗組)即轉染沉默ANO1-AS1慢病毒載體；sh-NC(陰性對照組)即轉染沉默慢病毒空載體；Blank(空白對照組)即未轉染慢病毒。

1.3 總RNA提取及qRT-PCR用TRIzol試劑裂解各組細胞，提取細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，按SYBR Green PCR試劑盒說明進行qRT-PCR檢測。引物序列見表1，β-actin為內參。利用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

表1 引物序列

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力按分組消化收集細胞，計數按分組以2 000個/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔。培養0、24、48、72、96 h時，在每孔中加入 10 μl CCK-8試劑，繼續培養箱孵育2 h，用酶聯免疫檢測儀測量各孔450 nm處的吸光度(optical density, OD)值。

1.5 平板克隆形成實驗按分組收集細胞并計數，接種于6孔板中(300個/孔)，每2～3 d換液，培養12～14 d。當出現肉眼可見的克隆時，使用PBS洗滌細胞2～3次，用4%多聚甲醛固定45 min，結晶紫染色20 min，大于50個細胞為1個克隆，顯微鏡下計數克隆形成數并計算克隆形成率。

1.6 Western blot收集細胞并提取細胞總蛋白，加入上樣緩沖液混勻，100 ℃煮10 min變性，取8～10 μl上樣，根據目的蛋白制備適宜濃度SDS-PAGE膠進行電泳，轉至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉3 h，加入一抗(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，洗膜后加入二抗(1 ∶20 000稀釋)，室溫孵育1 h。洗膜后加入化學發光液使用化學發光成像儀進行曝光。β-actin蛋白條帶作為內參對照。采用 Image J 軟件測算各蛋白條帶灰度值。

1.7 LinkedOmics數據庫LinkedOmics數據庫(www.linkedomics.org)是利用TCGA數據庫進行在線分析的工具。具體步驟：① 腫瘤類型：TCGA_ESCA；② 數據類型：RNAseq；③ 目的基因名：ANO1；④ 靶標數據類型：RNAseq；⑤ 統計方法：Pearson相關性分析，即可獲取ANO1正相關表達基因集，選擇GSEA富集分析工具，對ANO1正相關基因進行KEGG pathway富集，FDR值小于0.05的納入條件。

2 結果

2.1 轉染沉默慢病毒后ANO1-AS1的表達降低在食管癌EC109和TE-1細胞株中轉染ANO1-AS1沉默慢病毒后，通過qRT-PCR驗證各組沉默效率。結果如圖1所示，TE-1和EC109兩組細胞中sh-ANO1-AS1組ANO1-AS1表達水平均低于sh-NC組及Blank組，差異有統計學意義(F=109.957，P<0.001；F=94.943，P<0.001)。

2.2 沉默ANO1-AS1可抑制食管癌細胞增殖和克隆形成能力CCK-8實驗結果顯示，轉染沉默慢病毒后，TE-1細胞系sh-ANO1-AS1組從24 h開始OD值較sh-NC組及Blank組減小，差異有統計學意義(F=149.835，P<0.001)；EC109細胞系sh-ANO1-AS1組OD值從24 h開始低于sh-NC組及Blank組，差異有統計學意義(F=26.584，P=0.001)，見圖2A、2B。

圖2 敲低ANO1-AS1對食管癌細胞TE-1和EC109增殖的影響A：CCK-8法檢測TE-1細胞系各組細胞增殖情況；B：CCK-8法檢測EC109細胞系各組細胞增殖情況；C、D：TE-1及EC109兩細胞系各組細胞克隆形成情況；與sh-NC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與Blank組比較：#P<0.05，##P<0.01

平板克隆形成實驗結果顯示，沉默ANO1-AS1后，TE-1細胞系sh-ANO1-AS1組克隆形成率低于sh-NC組和Blank組，差異有統計學意義(F=211.858，P<0.001)；同樣，EC109細胞系sh-ANO1-AS1組克隆形成率低于sh-NC組及Blank組，差異有統計學意義(F=979.284，P<0.001)，見圖2C、2D。

2.3 敲低ANO1-AS1表達對PCNA及P53蛋白表達的影響Western blot檢測沉默ANO1-AS1后，PCNA和P53蛋白的表達情況，結果顯示，與sh-NC組及Blank組相比，TE-1和EC109兩細胞系中sh-ANO1-AS1組PCNA的表達減少(F=241.638，P<0.001；F=500.044，P<0.001)，P53的表達增加(F=141.118，P<0.001；F=205.268，P<0.001)，sh-NC組及Blank組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 下調ANO1-AS1對食管癌細胞TE-1和EC109中PCNA和P53蛋白表達的影響A：Western blot檢測兩細胞系各組PCNA和P53蛋白表達情況；B：PCNA蛋白相對表達量；C：P53蛋白相對表達量；a：Blank組；b：sh-NC組；c：sh-ANO1-AS1組；與sh-NC組比較：***P<0.001

2.4 下調ANO1-AS1對凋亡相關蛋白的影響Western blot檢測沉默ANO1-AS1后細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達變化，結果顯示TE-1和EC109兩細胞系中，與sh-NC組及Blank組相比，sh-ANO1-AS1組Bax表達增加，差異均有統計學意義(F=652.139，P<0.001；F=28.672，P=0.001)；與sh-NC組及Blank組相比，兩細胞系sh-ANO1-AS1組Bcl-2的表達均減少，差異有統計學意義(F=206.288，P<0.001；F=55.445，P<0.001)，見圖4。

圖4 沉默ANO1-AS1對食管癌細胞TE-1和EC109凋亡相關蛋白表達的影響A：Western blot檢測兩細胞系各組細胞Bax和Bcl-2的表達；B：Bax蛋白相對表達量；C：Bcl-2蛋白相對表達量；a：Blank組；b：sh-NC組；c：sh-ANO1-AS1組；與sh-NC組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.5 沉默ANO1-AS1后ANO1的表達降低qRT-PCR及Western blot結果均顯示：沉默ANO1-AS1后，TE-1細胞系sh-ANO1-AS1組ANO1的mRNA及蛋白表達低于sh-NC組及Blank組，差異有統計學意義(F=55.766，P<0.001；F=1 183.685，P<0.001)；同樣，EC109細胞系sh-ANO1-AS1組ANO1的表達低于sh-NC組及Blank組，差異有統計學意義(F=170.199，P<0.001；F=191.339，P<0.001)，見圖5。

圖5 沉默ANO1-AS1表達后ANO1表達降低A：qRT-PCR檢測下調ANO1-AS1后TE-1和EC109細胞中ANO1 mRNA的表達；B：Western blot檢測下調ANO1-AS1后TE-1和EC109細胞中ANO1蛋白的表達；C：ANO1蛋白相對表達量；a：Blank組；b：sh-NC組；c：sh-ANO1-AS1組；與sh-NC組比較：***P<0.001；與Blank組比較：#P<0.05

2.6 ANO1正相關基因及相關通路富集通過LinedOmics在線數據庫，篩選到食管癌數據集中與ANO1表達正相關基因，并根據相關性由高到低進行排序并展示Pearson相關系數>0.5的基因(圖6A)。通過GSEA富集分析工具，對ANO1正相關表達的基因可能調節的通路進行富集(圖6B)，并選擇PI3K/Akt通路進行驗證。

圖6 LinedOmics在線數據庫食管癌中ANO1正相關表達基因(A)和GSEA通路富集情況(B)

2.7 敲低ANO1-AS1可能影響PI3K/Akt通路蛋白的表達Western blot檢測沉默ANO1-AS1后，PI3K/Akt通路蛋白的表達和磷酸化修飾情況，結果顯示：下調ANO1-AS1后，TE-1及EC109兩細胞系中均發現，與sh-NC組及Blank組相比，sh-ANO1-AS1組PI3K和Akt蛋白磷酸化水平均降低，差異有統計學意義(F=536.088，P<0.001；F=418.073，P<0.001)，見圖7。

圖7 下調ANO1-AS1表達對PI3K/Akt通路相關蛋白表達的影響A：Western blot檢測兩細胞系各組細胞PI3K/Akt通路相關蛋白的表達；B：PI3K蛋白磷酸化水平(p-PI3K/PI3K)；C：Akt蛋白磷酸化水平(p-Akt/Akt)；a：Blank組；b：sh-NC組；c：sh-ANO1-AS1組；與sh-NC組比較：***P<0.001

3 討論

近年來，大量研究證實，非編碼RNA的異常表達與ESCC等消化道腫瘤的發生發展密切相關，并在其增殖、轉移、凋亡等多種生物學過程中發揮重要作用[9-10]，其中包括許多反義LncRNA[7]，例如：KRüppel樣因子3反義RNA 1(KLF3-AS1[11])在ESCC表達上調從而使其正義鏈KLF3發生激活，進而抑制食管癌細胞的遷移和侵襲。鋅指蛋白667反義RNA 1 (ZNF667-AS1[12])與其正義鏈ZNF667在食管癌中均高表達，并抑制ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲，ZNF667-AS1的過度表達增加了ZNF667的mRNA和蛋白表達水平。本課題組通過芯片篩選發現多個LncRNAs在ESCC中表達上調[8]，其中高表達的ANO1-AS1在ESCC中發揮何種生物學功能尚無明確報道，故本研究通過體外實驗進行了探究。

ANO1-AS1位于人類染色體11q13.3上，大小為722個堿基，由鈣離子激活氯離子通道蛋白1 (anoctamin 1，ANO1)基因反義鏈轉錄，為ANO1的反義LncRNA。Yu et al[13]發現， ANO1在ESCC中表達上調。有研究[14]證實敲除ESCC細胞系中的ANO1可抑制細胞增殖、誘導凋亡和減少腫瘤生長。ANO1-AS1的異常表達，提示其可能在ESCC的發生發展中發揮重要作用。為了進一步探究其對ESCC細胞生物學功能的影響，本研究同時向ESCC細胞系TE-1和EC109中轉染沉默ANO1-AS1慢病毒抑制其表達水平并在此基礎上進行后續功能學實驗。結果顯示，下調ANO1-AS1后，TE-1及EC109ESCC細胞增殖能力及克隆形成能力降低。PCNA是腫瘤細胞異常增殖的標志性蛋白，可反映腫瘤細胞增殖情況；P53則為抑癌基因，其失活將導致細胞獲得無限增殖能力，從而發生惡性癌變。本研究表明，沉默ANO1-AS1后，PCNA蛋白表達降低，同時抑癌基因P53蛋白表達升高，進一步證明敲除ANO1-AS1，ESCC細胞的增殖能力受到抑制。同時，下調ANO1-AS1后，ESCC細胞中促凋亡蛋白Bax表達增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，說明沉默ANO1-AS1可能促進食管癌細胞發生凋亡。本研究還發現，下調ANO1-AS1的表達，ANO1的mRNA和蛋白表達均降低。以上結果提示，ANO1-AS1可能發揮促癌基因作用，影響ESCC細胞的增殖和凋亡，且ANO1-AS1與ANO1存在正相關表達。

有研究[14]顯示，高表達的ANO1通過激活EGF受體(EGFR)和鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)，從而誘導Akt和絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK)信號的激活，促進ESCC的發生。為進一步探究ANO1-AS1在ESCC細胞中發揮功能的可能機制，本研究通過對食管癌中與ANO1正相關表達的基因進行通路富集，結果提示可能影響PI3K/Akt信號通路。活化的PI3K通過刺激其下游因子Akt來調節細胞的存活、增殖及代謝等過程。通過體內外實驗證實，該通路的PI3K、Akt及mTOR等關鍵分子在ESCC中均有高表達和激活[15]。本研究顯示，沉默ANO1-AS1后，PI3K及Akt蛋白磷酸水平下降，提示PI3K/Akt信號通路活性降低。以上結果提示抑制ANO1-AS1表達可能影響PI3K/Akt通路的活化進而降低ESCC細胞增殖能力，促進其發生凋亡。結合以上結果，推測其作用機制有以下可能：① ANO1-AS1本身具有直接調控PI3K/Akt信號通路關鍵分子表達和磷酸化修飾的作用進而影響食管癌生物學行為；② ANO1-AS1與ANO1兩者之間存在直接或間接調控作用進而調節通路活性影響食管癌進程。這為ANO1-AS1在ESCC中作用機制的進一步研究提供了方向。

綜上所述，抑制 ANO1-AS1可能影響PI3K/Akt通路活性從而降低ESCC細胞增殖能力，誘導其發生細胞凋亡。提示ANO1-AS1可能通過影響ESCC的增殖及凋亡，發揮促癌基因作用，為ANO1-AS1的進一步研究及ESCC的早期診治提供一定理論依據。