TLR4/HIF-1α信號通路介導糖化低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷

邱軍輝，劉美志，孫杜桑，潘 婷，趙維維，沙雯君，魯 郡，雷 濤，

糖尿病是全球增長最快的疾病之一，預計到2045年將影響6.93億成年人[1]。近年來，我國糖尿病的發病率逐年升高，其主要危害在于糖尿病的慢性并發癥，而糖尿病最主要的慢性并發癥是血管病變[2]。研究[3]顯示血管內皮功能損傷既是血管病變的重要病理基礎，也是糖尿病預后的決定性因素。糖尿病患者體內多同時存在高血糖和脂代謝紊亂狀態，低密度脂蛋白極易發生非酶促糖基化，形成糖化低密度脂蛋白(glycated low density lipoprotein，Gly-LDL)[4]。Gly-LDL能夠影響內皮細胞形態和功能，但具體作用機制尚未闡明。該研究旨在探討Gly-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎癥反應的具體機制，為防治血管內皮損傷提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 HUVECs購自上海中科院細胞研究所。

1.1.2主要試劑 LDL Human購自廣州奕元生物科技有限公司；葡萄糖購自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所； ECM購自美國ScienCell公司；0.25%胰酶消化液購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購自上海碧云天生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司； PrimeScriptTMRT Master Mix Kit和SYBR?Primix Ex TagTMKit購自美國TaKaRa公司；Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6) 、β-actin抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、HRP 標記的兔抗小鼠IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.1.3主要儀器 細胞超凈工作臺購自ESCO公司；全波長酶標儀購自Bio-Rad公司；熒光顯微鏡購自美國萊卡公司；電泳系統購自美國Bio-Rad公司；離心機購自Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1Gly-LDL的制備 參考文獻[5]報道，在無菌條件下，將0.2 mol/L葡萄糖與2 g/L LDL Human在37 ℃培養箱中避光孵育4周，同時加入1 g/L EDTA和10 μmol/L二丁基羥基甲苯。第1、7、14、21、28天提取100 μl樣品保存于-80 ℃，檢測Gly-LDL水平。孵育完成后在pH 7.4 的PBS緩沖液中透析48 h備用。

1.2.2細胞培養 從液氮中取出凍存細胞，在37 ℃水浴鍋中解凍并離心，用完全培養基復蘇細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖活力 將處于對數生長期的HUVECs制備細胞懸液，按照1×104個細胞/孔的密度將細胞懸液接種至96孔板中，每孔100 μl，每組設立5個重復孔。待細胞完全貼壁后，按照不同干預措施將細胞分為對照組、陽性對照組[50 mg/L普通低密度脂蛋白 (normal low density lipoprotein, n-LDL]、Gly-LDL (50、75、100 mg/L) 組，干預24 h后用含10% CCK-8的培養基進行換液，避光孵育，每隔30 min使用酶標儀測定每組在450 nm處的吸光度，取各組實驗的平均值，重復3次實驗。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移能力 在6孔板中以2×105個細胞/孔的密度培養細胞，待細胞長至80%～90%時，用槍頭于板底劃線，PBS洗去漂浮細胞，更換含1%FBS低血清培養基后加入不同濃度Gly-LDL繼續培養，于顯微鏡下拍攝0 h細胞劃痕圖片，12 h后在同一位置拍攝圖片，計算劃痕區域面積，求得愈合率。

1.2.5ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)含量 取24 h后各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1含量。

1.2.6qRT-PCR檢測HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA水平 在6孔板中培養內皮細胞，干預24 h后收集各組內皮細胞，按說明書提取內皮細胞中總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR進行目的基因擴增。PCR擴增體系：2×TB Green 10.0 μl，引物各0.4 μl，引物序列見表1，50×ROX ReferenceDye Ⅱ 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl，總體系20 μl。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環，95 ℃延伸15 s。以β-actin為內參，2-ΔΔCt計算。

表1 引物序列

1.2.7Western blot檢測TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白水平 將3～4代HUVECs細胞接種于6孔板中，每孔2×105個細胞，待細胞長至80%時，將完全培養基更換成低血清培養基進行饑餓處理8 h，對細胞進行干預處理24 h后，吸棄6孔板中培養基，預冷PBS洗滌2次，每孔加入120 μl RIPA裂解液置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液至預冷離心管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書步驟對各組樣品進行定量檢測，加入適量蛋白上樣緩沖液后100 ℃加熱5 min變性。取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，再將蛋白轉移到PVDF膜，用5%BSA室溫封閉1 h，洗膜后分別加入TLR4一抗(1 ∶1 000)、HIF-1α一抗(1 ∶1 000)、TNF-α一抗(1 ∶1 000)、IL-6一抗(1 ∶1 000)、β-actin一抗(1 ∶5 000) 4 ℃孵育過夜，次日TBST漂洗PVDF膜3次，5 min/次，加入二抗(1 ∶20 000)室溫搖床孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次。暗室ECL顯影獲取圖片，用ImageJ軟件分析出各組蛋白與內參的灰度值，得出各組蛋白與內參的灰度比值，反映出各組蛋白的相對表達水平。

1.2.8Gly-LDL干預下沉默TLR4、HIF-1α后TLR4、HIF-1α蛋白表達水平 在6孔板中接種3～5代細胞，每孔細胞數約為2×105個，在恒溫培養箱中培養細胞生長至80%左右開始后續實驗。轉染前將培養基換成不含血清和雙抗的培養基，以免影響轉染效率。分別設為對照組、模型組(Gly-LDL 100 mg/L)、si-TLR4組(Gly-LDL 100 mg/L+si-TLR4)、TLR4空載組(Gly-LDL 100 mg/L+si-NC1)、si-HIF-1α組(Gly-LDL 100 mg/L+si-HIF-1α)和HIF-1α空載組(Gly-LDL 100 mg/L+si-NC2)。提前將si-TLR4、si-NCl、si-HIF-1α、si-NC2凍干粉用原裝DEPC水進行溶解，取siRNA，用opti-MEM培養基稀釋siRNA，終濃度為10 μmol/L，總體積為250 μl，靜置5 min；同時取2 μl Lipofectamine 2000與248 μl opti-MEM培養基混勻，靜置5 min。將上述兩種液體混合，靜置20 min。每孔先加入1 500 μl opti-MEM培養基，20 min之后將500 μl混合液加入6孔板中。6 h后將opti-MEM更換為完全培養基，繼續培養48 h，后續根據實驗需要進行下一步操作。實驗重復3次。小干擾序列見表2。

表2 小干擾序列

2 結果

2.1 Gly-LDL對HUVECs增殖活力的影響不同濃度Gly-LDL處理內皮細胞，在24 h檢測細胞增殖活力的改變，CCK-8法檢測結果顯示：細胞活力差異有統計學意義(F=69.96,P<0.001)，與對照組OD值(1.09±0.10)相比，n-LDL組OD值(0.96±0.03)顯示對HUVECs增殖活力無影響，差異無統計學意義(P>0.05)；而Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組OD值分別為(0.70±0.03)、 (0.59±0.02)、 (0.53±0.03)，與對照組相比，細胞存活率分別下降36.16%、45.77%、51.24%，呈劑量依賴性(P<0.01)；與n-LDL組相比，Gly-LDL 50 mg/L組細胞存活率下降27.08%(P<0.001)。

2.2 Gly-LDL對HUVECs遷移能力的影響不同濃度Gly-LDL處理HUVECs，在12 h檢測細胞遷移能力的改變，細胞劃痕實驗結果(圖1)顯示：細胞遷移能力差異有統計學意義(F=139.85,P<0.001)，與對照組愈合率(52.03±1.79)相比，n-LDL組愈合率(48.55±1.93)顯示對細胞遷移能力無影響，差異無統計學意義(P>0.05)；而Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組愈合率分別為(35.88±2.40)、(22.68±3.10)、(17.65±1.59)，與對照組相比，細胞遷移率分別下降31.04%、56.40%、66.08%，呈劑量依賴性(P<0.001)；與n-LDL組相比，Gly-LDL 50 mg/L組細胞遷移率下降26.10%(P<0.01)。

圖1 細胞劃痕實驗檢測不同濃度Gly-LDL對HUVECs遷移能力的影響 ×100

2.3 Gly-LDL對HUVECs細胞因子表達的影響ELISA法檢測TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1分泌水平，結果(表3)顯示：各組TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1分泌量差異有統計學意義(F=333.80、68.91、127.07、79.56，P<0.001)，與對照組相比， n-LDL組TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組相比，Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與n-LDL組相比，Gly-LDL 50 mg/L組中TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平增高，其中TNF-α、IL-6、ICAM-1分泌水平差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 Gly-LDL對HUVECs細胞因子表達的影響

2.4 Gly-LDL對HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響不同濃度Gly-LDL處理細胞24 h后，qRT-PCR結果(圖2)顯示：各組TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達量差異有統計學意義(F=174.35、275.06、126.54、109.70，P<0.05),與對照組相比，n-LDL組和Gly-LDL(50、75、100 mg/L)組誘導的HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與n-LDL組相比，Gly-LDL(75、100 mg/L)組中TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA水平增高，差異有統計學意義，并呈劑量依賴性(P<0.05)。

圖2 Gly-LDL對HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響A：對照組；B：n-LDL組；C：Gly-LDL 50 mg/L組；D：Gly-LDL 75 mg/L組；E：Gly-LDL 100 mg/L組；與對照組比較：*P<0.05；與n-LDL組比較：#P<0.05

2.5 Gly-LDL對HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達的影響不同濃度Gly-LDL處理細胞24 h后，Western blot檢測炎癥蛋白TLR4，HIF-1α、IL-6、TNF-α水平，結果(圖3)顯示：各組TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表達量差異有統計學意義(F=47.63、42.80、78.25、21.13，P<0.001)，與對照組相比，n-LDL組中TLR4、TNF-α蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組相比，Gly-LDL 50 mg/L 組中HIF-1α、TNF-α蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，Gly-LDL 75、100 mg/L組中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 Gly-LDL對TLR4/HIF-1α信號通路相關蛋白的影響A：對照組；B：n-LDL組；C：Gly-LDL 50 mg/L組；D：Gly-LDL 75 mg/L組；E：Gly-LDL 100 mg/L組；與對照組比較：*P<0.05；與n-LDL組比較：#P<0.05

2.6 檢測HUVECs中沉默TLR4、HIF-1α蛋白效率分別用si-TLR4、si-HIF-1α轉染HUVECs，Western blot結果(圖4)顯示：與si-NC組相比，si-TLR4組中TLR4蛋白表達下調44.18%，差異有統計學意義(P<0.001)；與si-NC組相比，si-HIF-1α組中HIF-1α蛋白表達下調69.10%，差異有統計學意義(P<0.001)。

圖4 si-TLR4和si-HIF-1α對HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白沉默的影響A：沉默TLR4效率檢驗；B：TLR4蛋白統計分析圖；C：沉默HIF-1α效率檢驗；D：HIF-1α蛋白統計分析圖；與si-NC組比較：***P<0.001

2.7 Gly-LDL干預下沉默TLR4、HIF-1α后對HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白表達的影響分別用si-TLR4、si-HIF-1α轉染HUVECs后，按照實驗分組加入100 mg/L Gly-LDL干預24 h，結果(圖5)顯示：與對照組相比，模型組中TLR4、HIF-1α蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型組相比，si-TLR4組中TLR4、HIF-1α蛋白表達均降低(P<0.05)；與模型組相比，si-HIF-1α組中HIF-1α蛋白表達降低(P<0.05)，TLR4蛋白表達差異無統計學意義；與對照組相比，si-HIF-1α組中TLR4蛋白升高(P<0.05)。

圖5 沉默TLR4、HIF-1α對HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白表達的影響A：對照組；B：模型組；C：si-TLR4組；D：TLR4空載組；E：si-HIF-1α組；F：HIF-1α空載組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

糖尿病是一種以糖代謝紊亂為主的臨床綜合征，糖尿病大血管并發癥是糖尿病患者致殘致死主要原因[6]，血管內皮損傷是導致糖尿病大血管并發癥的關鍵因素[7-8]。因此，血管內皮損傷是防治糖尿病大血管病變的重要關注點。目前認為，血管內皮損傷的出現，在于糖尿病高血糖時，體內各種蛋白非酶促糖基化反應增強。而晚期糖基化蛋白終末產物(advanced glycated end products，AGEs)可損害內皮細胞的形態及其功能，從而誘發糖尿病血管病變[9-10]。Gly-LDL是AGEs中最主要成分之一，但目前Gly-LDL與糖尿病血管內皮損傷的關系僅停留在相關性研究中。本研究用Gly-LDL(50、75、100 mg/L)處理HUVECs 24 h，存活率降低36.16%、45.77%和51.24%；遷移率降低31.04%、56.40%和66.08%；并促進TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1細胞因子分泌，表明Gly-LDL能夠降低細胞生存率和遷移能力，促進炎癥因子釋放，并呈濃度依賴性。

大量研究[11-12]顯示糖尿病血管內皮損傷與TLR4信號激活有關。在血管內皮病變患者外周血中，巨噬細胞表現為TLR4信號過度激活，使機體處于高度促炎狀態[13]。TLR4參與糖尿病病理生理過程，TLR4能夠調節NADPH氧化酶活性，導致體內活性氧增加，加速糖尿病大血管并發癥發展[14]；在糖尿病血管內皮損傷中，樹突狀細胞通過RAGE-TLR4-PKCβ1信號通路介導慢性炎癥反應[15]；高遷移率組蛋白(high mobility group protein B1,HMGB1)在糖尿病發生過程中通過TLR4/eNOS通路參與內皮依賴性舒張功能損傷[16]。為了驗證Gly-LDL是否通過TLR4信號通路介導血管內皮炎癥反應，本研究選用HUVECs作為研究對象，結果顯示Gly-LDL能提高HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白水平，表明Gly-LDL能夠激活TLR4信號通路，促進炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，介導血管內皮細胞損傷。但是Gly-LDL通過TLR4信號如何調控炎癥反應，是目前尚未解決的科學問題。研究[17]表明TLR4信號能夠調控HIF-1α影響TNF-α、IL-1β分泌，HIF-1α是人和哺乳動物中關鍵核轉錄因子，常氧狀態下HIF-1α的脯氨酰胺基和門冬酰胺基發生羥基化，與E3泛素化連接酶結合，VHL蛋白能募集泛素連接酶，與泛素化連接酶結合的HIF-1α被蛋白酶體降解；低氧狀態下，HIF-1α羥基化被抑制，與HIF-1β結合，在細胞核內與缺氧反應元件結合，激活靶基因轉錄[18]。HIF-1α能夠調節血管內皮生長因子和葡萄糖轉運蛋白1表達，并且涉及炎癥反應[19]。為了驗證TLR4能否調控HIF-1α表達，在Gly-LDL干預下沉默TLR4、HIF-1α基因，結果顯示：Gly-LDL能夠上調TLR4和HIF-1α蛋白水平，表明兩者可能存在協同作用；沉默TLR4基因后，TLR4和HIF-1α蛋白表達下調，而沉默HIF-1α基因后，只有HIF-1α蛋白表達下調，而TLR4蛋白在Gly-LDL干預下仍是上調，因此推測，Gly-LDL上調TLR4信號，激活HIF-1α表達介導HUVECs炎癥反應。

綜上所述，本研究結果顯示：Gly-LDL能夠上調TLR4信號，激活HIF-1α的表達介導炎癥因子釋放，降低HUVECs生存率和遷移能力，誘導HUVECs損傷。Gly-LDL水平有望成為衡量糖尿病血管內皮損傷指標之一，并為糖尿病血管內皮損傷臨床治療提供新的潛在靶點。