基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 和網絡藥理學探討百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的作用機制

邱心悅，石潤玉，袁志鷹*， 趙洪慶*

（1.湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

焦慮性抑郁癥是一種以抑郁癥狀為主，且伴隨著顯著焦慮情緒的精神障礙類疾病。臨床研究顯示，85%的抑郁癥患者有不同程度的焦慮情緒，焦慮情緒是導致抑郁癥治療阻抗最主要的因素之一[1]。 因而，焦慮性抑郁癥患者具有更重的社會功能損害和更高的自殺率[2]。 焦慮性抑郁癥屬于中醫情志病范疇，古代雖無其病名，但與東漢張仲景所著《金匱要略》中“百合病”癥狀極為類似，患者表現出“意欲食復不能食，欲臥不能臥，欲行不能行”“常默默”“如寒無寒，如熱無熱”等[3]。 現代醫學的抑郁、焦慮行為，結合臨床表現及中醫證候特點，認為其基本病機可用基于腦府和肝臟的“瘀、郁”概括[4]。 百合疏肝安神湯是課題組基于仲景論治百合病的學術思想，緊扣抑郁癥“瘀、郁”的中醫病因病機特點，以疏肝理氣、活血安神為治法，結合多年臨床實踐研制而成，主治伴焦慮、失眠型抑郁癥，前期研究表明其具有良好的抗焦慮抑郁療效[5-6]，但由于中藥復方存在多成分、多靶點的特點，使得相互作用機制并不明確。

網絡藥理學是基于生物學、藥理學、生物信息學、計算機科學等多學科融合而成的一門學科。與傳統的單成分、單靶點思維不同，其多成分、多靶點、多通路的網絡構建思維更適用于中藥復方的復雜特性，能夠減少中藥復方研究的盲目性，更便于發現治療疾病的潛在靶標與分子機制[7]。 但是，單純運用現有化學成分數據庫對中藥材進行成分篩選，并進行網絡藥理學研究極有可能導致過濾掉藥物的某些有效成分，且工作量大，潛在靶點多，不利于后續驗證實驗的開展。 本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術對中藥復方進行成分分析，明確藥物的藥效物質基礎，再結合網絡藥理學技術探明百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的活性成分及潛在靶點，闡明該方的作用環節、途徑與靶點，將有助于該方藥的進一步開發應用。

1 材料與方法

1.1 百合疏肝安神湯化學成分分析

1.1.1 色譜條件和質譜條件 色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm)，流動相由有機相乙腈（A）和水相（B）組成，其中水相B 中含0.05 mmol·L-1甲酸銨(質譜級)，設置梯度洗脫程序：0～5 min，5%～15% A；5～10 min，15%～35% A；10～20 min，35%～65% A；20～30 min，65%～95% A；流速：0.4 mL/min，進樣量：1 μL。

質譜檢測條件：采用正負離子分析模式，離子化方式為電噴霧離子化(ESI)。一級質譜掃描檢測范圍：m/z 100～1700，采用氮氣為除溶劑干燥氣體，溫度為325 ℃，流速為6.8 L/min；鞘氣溫度為350 ℃；毛細管電壓為4.0 kv，Fragment 電壓為150 V；二級質譜掃描范圍：m/z 50～1000。

1.1.2 百合疏肝安神湯樣品溶液的制備 百合疏肝安神湯由百合、柴胡、貫葉金絲桃、姜黃、酸棗仁、人參、紫蘇7 味藥物組成，藥材飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，經湖南中醫藥大學藥學院袁志鷹副教授鑒定為正品。全方煎煮2 次，每次均加入6倍體積水，合并水煎液，濃縮至生藥量為1 g/mL 備用。 取1 mL 濃縮液，加20 mL 甲醇，超聲20 min，10 000 r/min 離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液，經0.22 μm 有機微孔濾膜濾過，即得百合疏肝安神湯的樣品溶液。

1.1.3 百合疏肝安神湯的化學成分鑒定 采用全掃描-動態排除和數據依賴性掃描，基于Agilent 1290 UPLC-6540 accurate mass Q-TOF 色譜-質譜(UPLC-Q-TOF-MS)聯用技術對百合疏肝安神湯中的化學成分進行檢測和數據采集。 采用Mass Hunter B.07.00 軟件對正負離子模式的一、二級質譜提供的離子峰信息進行分析，根據文獻推測總結不同類別化合物的質譜裂解規律，對于已知化合物，通過提取離子流圖和比對相關對照品保留時間等達到準確快速鑒定，對于未知化合物，通過精確分子量預測化合物分子式，結合相關質譜裂解規律、文獻數據、多級質譜碎片信息達到快速鑒定。

1.2 百合疏肝安神湯網絡藥理學研究

1.2.1 作用靶點預測 通過中藥系統藥理學數據庫分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）將“1.1.3”中檢測出的化學成分進行信息檢索，得到百合疏肝安神湯活性成分的靶標蛋白。 借助STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins 搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白質名稱，限制物種為“Homo sapiens”， 查詢與目標蛋白質相對應的基因名稱，并校準所得蛋白質，同時剔除非目標活性成分，獲得活性成分與相關靶點的信息。

1.2.2 疾病靶點的獲取與收集 在GeneCards（https://www.genecards.org/）中以關鍵詞“anxious depression”進行查詢，整合結果至Excel，與百合疏肝安神湯候選靶標蛋白共同上傳至VENNY 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進行匹配映射。

1.2.3 蛋白質相互作用（protein-protein interaction,PPI）的構建及其核心靶點、重要成分的篩選 為了解百合疏肝安神湯的具體作用機制，將共同基因導入STRING 11.5，限制物種為“Homo sapiens”，置信度為中等0.04，以此獲取PPI 關系。 再將各參數以tsv文件導入Cytoscape 3.8.0（https://cytoscape.org/），對節點度值進行分析，確定百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的核心靶點，進而得到對應的重要化學成分。

1.2.4 生物過程和通路分析 為了解核心基因的功能以及在信號通路中的作用，將共同靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），物種限制為“Homo sapiens”，閾值設定P＜0.05，進行基因本體論（gene ontology, GO）功能和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析，再借助ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）和GraphPad Prism 7.0 將結果可視化。

1.2.5 “活性成分-核心靶點-重要通路”網絡的構建 將結果所得的成分、靶點、通路等信息在Excel中建立三者的數據文件和屬性文件，導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建“活性成分-核心靶點-重要通路”網絡。

2 結果

2.1 百合疏肝安神湯主要化學成分

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術分析得到百合疏肝安神湯總離子流圖，見圖1。 經文獻對比，完成色譜峰對應化合物的定性分析，得到78 個化合物，主要包括精氨酸、葡萄糖酸、檸檬酸、異檸檬酸、郁金香苷A 等。 詳見表1。

表1 百合疏肝安神湯主要化學成分

續表1

圖1 百合疏肝安神湯正負離子模式總離子流圖譜

2.2 藥物及疾病共同基因的篩選

利用TCMSP 檢索得到藥物靶點144 個，去除重復基因后有101 個；通過GeneCards 檢索所得疾病靶點1338 個，無重復基因。將二者上傳至Venny 2.1.0匹配映射后，獲取共同靶點52 個。 詳見圖2。

圖2 百合疏肝安神湯中化合物及其與焦慮性抑郁癥相關靶點的交集基因

2.3 PPI 網絡的構建與分析

借助STRING 11.5 數據庫構建PPI，共得到11個節點和644 條邊，見圖3。 將共同靶點及對應成分導入Cytoscape 3.8.0，對網絡中各個節點的度值大小進行比較分析，節點的平均度值為58.55，以大于等于兩倍中心平均度值為標準，得到治療焦慮性抑郁癥作用靶點8 個， 分別為CAT、IL-1β、PTGS2、IL-6、INS、CASP3、SRC、MYC，見表2，對應化合物14 個，具體見表3。

表2 拓撲分析8 個核心靶點信息

表3 拓撲分析14 個重要化合物信息

圖3 百合疏肝安神湯與焦慮性抑郁癥PPI 核心網絡

2.4 生物過程和通路富集分析

DAVID 中GO 功能富集分析中獲得的GO 條目共252 個（P＜0.05），其中包括生物過程（biological process, BP）條目181 個，涉及對藥物的反應、一氧化氮生物合成過程的正向調節、細胞對雌二醇刺激的反應等；細胞組成（cellular component, CC）條目31 個，涉及神經元投影、細胞溶質、膜式筏板等；分子功能（molecular function, MF）條目40 個，涉及血紅素結合、NADP 綁定、蛋白質同型二聚體活性等。該結果中BP、CC 和MF 分別占71.8%、12.3%和15.8%，運用GraphPad Prism 7.0 對GO 功能富集分析結果進行可視化處理，結果見圖4。

圖4 百合疏肝安神湯活性成分潛在靶點的GO 功能富集分析

KEGG 通路富集結果經過濾選擇共獲得82 條信號通路（P＜0.05），涉及HIF-1 信號通路、PI3KAkt 信號通路、NF-κB 信號通路等。運用ImageGP 對富集分析結果進行可視化處理。 詳見圖5。

圖5 百合疏肝安神湯活性成分潛在抗焦慮性抑郁癥靶點的KEGG 代謝通路富集分析

2.5 百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點-重要通路”網絡

百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點-重要通路”網絡如圖6 所示。 該網絡中共涉及30 個節點（包括12 個化合物節點、8 個靶點節點、10 個通路節點）和156 條邊，平均相鄰節點數目為5.20。 結果表明百合疏肝安神湯中存在化合物與多個靶點相互作用的機制，同時存在幾種化合物同時擴散至同一靶標的過程，最后作用于多種通路。

圖6 百合疏肝安神湯“活性成分-核心靶點-重要通路”網絡

3 討論

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術分析了百合疏肝安神湯的78 種活性成分，其中肉豆蔻醚、蘆丁、紫堇定堿等度值較大，且與核心靶點有較強的關聯性，表明其可能為百合疏肝安神湯治療焦慮性抑郁癥的重要活性成分。有研究指出，肉豆蔻醚表現出明顯的抗抑郁性質，其依賴于5-HT 功能的調節，抑制5-HT2A 受體活性達到緩解抑郁的作用[8-9]。 蘆丁是一種天然黃酮苷，屬于黃酮類化合物，研究表明其能夠增加大鼠進入高架十字迷宮開放臂的次數與時間，發揮抗焦慮作用[10]。 同時，黃酮類化合物能抑制單胺氧化酶活性，影響5-HT 的重吸收，起到抗抑郁的作用[11]。研究顯示，阿樸啡類生物堿具有抗氧化作用[12]，其機制可能通過對抗自由基絡合或者主動捕獲自由基的方式，阻止機體內脂質過氧化，進而發揮抗焦慮抑郁作用[13]。

由“活性成分-核心靶點-重要通路”網絡可知，PTGS2、IL-6、IL-1β 與PI3K-Akt 信號通路、NF-κB信號通路相連成分較多，可能為抗焦慮性抑郁癥的潛在靶點與通路。

PTGS2 又名環氧合酶2，是花生四烯酸合成前列腺素類物質的關鍵性限速酶，其含量高低能夠影響海馬、杏仁核等腦區的功能，可能參與焦慮性抑郁癥的病理進程[14]。PI3K-Akt/NF-κB 信號通路對于細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥的發生等發揮著不容忽視的作用[15]。PI3K-Akt 信號通路可與NF-κB 信號通路產生交叉反應，在一定程度上對其活性進行調節[16-17]。DOU 等[18]研究發現，PI3K-Akt 信號通路可能通過活化核轉錄因子進入細胞核，促進細胞增殖，抑制凋亡，進而達到抗焦慮性抑郁癥的作用。 同時，PI3KAkt 信號通路還可以通過增強NF-κB 抑制蛋白IκB激酶的磷酸化和降解，繼而導致NF-κB 的活化，誘導促炎因子(如TNF-α、IL-6 和IL-1β)釋放[19]。因此，百合疏肝安神湯可能通過介導PI3K-Akt、NF-κB 信號通路，抑制海馬細胞凋亡或促炎因子過量分泌來實現抗焦慮性抑郁癥作用。

綜上所述，本研究在百合疏肝安神湯化學成分的測定分析基礎上，利用網絡藥理學的分析方法，分析了百合疏肝安神湯14 種重要活性成分、8 個抗焦慮性抑郁的潛在作用靶點，可能通過肉豆蔻醚、蘆丁、紫堇定堿等活性成分作用于PTGS2、IL-6、IL-1β等潛在靶點，通過調控PI3K-Akt、NF-κB 等信號通路，在神經元投影、細胞溶質、膜式筏板等區域參與對藥物的反應、一氧化氮生物合成過程的正向調節、細胞對雌二醇刺激的反應、血紅素結合、NADP綁定、蛋白質同型二聚體活性等過程，發揮抗焦慮性抑郁癥作用。