水貂源肺炎克雷伯桿菌分離、鑒定及疫苗潛能分析

張國軍王殿永楊艷梅陳建國暢麗芳吳 金高玉龍楚洪源柳增善張媛媛

(1.吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室,長春 130062;2.吉林大學致遠有限公司,長春 130012;3.河北省昌黎縣動物疫病預防控制中心,河北昌黎 066600;4.吉林和元生物工程有限公司,吉林松原 138000;5.北京大學臨床醫學院,北京 100080)

水貂克雷伯桿菌性肺炎是水貂養殖過程中的常見病和多發病,常在7-10月份發生局部流行。在山東、河北、遼寧等地的水貂養殖場個別年份成年貂的發病率可達50%以上,主要癥狀為發熱,全身出現膿瘍,特別是頸部有許多小膿泡,肺出血、呼吸困難等臨床表現,嚴重者呈急性死亡[1-3]。

為了更好地控制本病,2010 年至2021 年期間,初步對山東、河北、遼寧等地疑似水貂肺炎克雷伯桿菌病病例進行病原分離與鑒定,利用分離菌對水貂的致病性、免疫原性及疫苗潛力進行分析,現將有關試驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2010年至2021年,先后從山東諸城、河北饒陽、遼寧大連等地區大型水貂養殖場或養殖戶的水貂無菌采集肺臟、肝臟、脾臟、腎臟作為病料。患病水貂以發熱、全身出現膿瘍,特別是頸部有許多小膿泡、肺出血、呼吸困難、急性死亡為特征。

1.1.2 培養基及氫氧化鋁膠 普通瓊脂、馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂培養基,購自中海生物科技有限公司。HiBio-IDTM系列微生物生化鑒定卡購自Hi-Media公司。普通肉湯與革蘭氏染色液由實驗室配制。氫氧化鋁膠購自河南通商進出口有限公司。

1.1.3 引物 16S r DNA 擴增引物(F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3')由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 試驗動物 10月齡健康易感青年貂購自遼寧省莊河市富貴養貂專業合作社,該合作社未曾接種過任何肺炎克雷伯桿菌疫苗,貂場也未曾發生疑似相關的呼吸道癥狀病例;新購貂在吉林和元生物工程股份有限公司動物房內飼養14 d后,臨床表現健康者用于動物回歸試驗和毒力測定。

1.1.5 儀器 恒溫培養箱購自江蘇新春蘭科學儀器有限公司,HZQ-QA/QB 型恒溫培養搖床購自蘇州威爾實驗用品有限公司。BX53M 正立金相顯微鏡購自杭州全譜實驗室設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與常規生理生化鑒定 細菌分離無菌操作從病死水貂體內采集肺臟、脾臟或肝臟及腎臟組織,劃線接種于普通瓊脂平板上,于37 ℃培養24～48 h,觀察菌落形態。挑取單個較大的灰白色黏稠菌落,接種于普通瓊脂平板劃線純化分離,確定純化無污染后挑取少量菌落接種于普通肉湯培養基中,37 ℃培養14～18 h,凍干保存,記為F0代,其余培養物作鑒定用。

細菌鑒定:取純培養的單個典型菌落作革蘭氏染色,鏡檢。純培養的單個菌落劃線接種于普通瓊脂、馬丁瓊脂、麥康凱瓊脂培養基平板上,置于37℃培養24 h,觀察細菌的生長狀態。取純培養物分別進行吲哚(靛基質)試驗,甲基紅(MR)試驗,VP試驗,明膠液化試驗,氧化酶試驗、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、鼠李糖、乳糖等糖的發酵試驗,觸酶試驗,硝酸鹽還原試驗,H2S試驗等常規生化試驗鑒定[4]。

1.2.2 分子生物學鑒定 根據臨床特征、菌落形態、革蘭氏染色、生化及致病性特點,選擇其中的FY2和FY3株細菌劃線純培養,16～20 h后,取平板內直徑不小于2 mm 的較大單菌落,全部挑入盛有100μL去離子水的1.5 m L 離心管內,沸水浴15 min。取出自然冷卻至室溫,12 000 r/min 離心5 min,取上清3 μL,用細菌的16S r RNA 引物擴增細菌16S r RNA。PCR 體系:Pre MixrTaq(2×)25μL,10μmol/L 上下游引物各1.5μL,模板(煮沸后上清)3μL,去離子水19μL。擴增條件:預變性94 ℃3 min;94 ℃30 s,50 ℃30 s,72 ℃1 min,30 個循環;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保溫。

擴增產物長度1 400 bp,純化后送吉林庫美生物科技股份有限公司進行序列測定。按常規方法將所得序列提交NCBI網站的BLAST 功能網頁進行核酸序列比對,網址為:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

1.2.3 動物回歸及毒力測定試驗 分別取6株分離細菌的單個菌落劃線接種于普通瓊脂平板上,置37 ℃培養18 h,刮取平板上所有菌落混于滅菌PBS(0.2 mol/L,p H 7.2)中,制成細菌懸液,無菌條件下進行10倍梯度稀釋,將不同濃度菌液分別接種于普通瓊脂平板,37 ℃培養18 h,計數,判定菌液濃度。將其濃度稀釋至1.0×106CFU/m L,以1.0 m L/只劑量肌肉注射10月齡健康易感青年貂5只,同時設立PBS注射對照組。攻毒后連續觀察14 d,每日記錄水貂的精神狀況、食欲、排便、活動及死亡情況,死亡貂立即解剖,觀察是否有病理變化,無菌采集臟器分離細菌。依據劑量和對動物致病結果確定菌株的毒力強弱。

1.2.4 強毒分離株對易感水貂最小完全致死量的確定 根據毒力回歸試驗結果,取其中2個典型強毒分離菌株純培養的單菌落,劃線接種于普通瓊脂平板上,置37 ℃培養18 h,刮取平板上所有菌落混于滅菌PBS中制成細菌懸液,以平板培養活菌計數法確定菌數,根據預試驗初步摸索的致病劑量,將其濃度稀釋至1.0×105、2.5×105、5.0×105、1.0×106、1.5×106CFU/m L 共5組,每組以1.0 m L/只劑量肌肉注射10月齡健康易感青年貂5只,同時設立水貂(滅菌PBS注射)對照組。所獲數據以Duncan氏顯著性檢測方法進行統計分析[5]。

攻毒后連續觀察14 d,每日記錄水貂的精神狀態、食欲、排便、活動及死亡情況,對死亡貂立即解剖,取內臟分離細菌。

1.2.5 強毒分離株的免疫原性試驗 將確定的強毒分離株接種普通肉湯培養24 h后,收集菌體制成20%氫氧化鋁膠佐劑滅活疫苗,配苗后每毫升抗原液菌數分別為1.0×109CFU、2.0×109CFU、3.0×109CFU、4.0×109CFU,用10月齡健康易感青年貂各5只,分別皮下注射1.0 m L。同時設不接種對照5只。接種后21 d,每只免疫和對照水貂各肌肉注射“1.2.3”中確定的強毒分離株最小完全致死劑量的高一滴度,觀測14 d。計算疫苗的免疫保護效果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果

從山東、河北、遼寧等地區的水貂樣品獲得6個可疑分離菌株,在普通瓊脂培養基上菌落呈圓形、濕潤、光滑、稍隆起、邊緣整齊的中等大灰白色黏稠菌落。挑取單個菌落進行革蘭氏染色,菌體為革蘭氏陰性粗短桿菌,呈單個或成對分布,偶爾呈鏈狀排列,無芽胞。

2.2 分離菌株的生化鑒定

生化鑒定結果表明,6株分離細菌的生化反應相同,能發酵所試驗的6種糖類,產酸產氣,不產生硫化氫,不液化明膠,吲哚(靛基質)陰性,過氧化氫酶陰性,觸酶陽性,VP陽性,甲基紅(MR)陰性,還原硝酸鹽,符合肺炎克雷伯菌的基本生化反應特征(表1),分別命名為FY1、FY2、FY3、FY4、FY5、FY6。

表1 6株分離菌主要生化反應結果Table 1 Main biochemical reaction results of 6 isolates

2.3 分子生物學鑒定結果

FY2和FY3菌株16S r RNA 的擴增片段大小為1 400 bp(圖1),與預期大小一致。將測序結果進行BLAST 比對分析表明,2 個擴增序列與GenBank 庫內序列號為NR074913.1 的ATCC 標準克雷伯氏菌菌株“Klebsiellapneumoniaesub sp.pneumoniaeMGH 78578 strain ATCC 700721; MGH 78578 16S ribosomal RNA,complete sequence”一致性為100%,與GenBank公布的肺炎克雷伯桿菌的16S r RNA(登 錄 號 為 KJ803939.1、HM585430.1、AB558500.1等)的一致性為99%。表明兩個分離菌株均為肺炎克雷伯桿菌(圖2)。

圖1 分離菌FY2和FY3株的16S r RNA擴增結果Fig.1 16S r RNA amplification results of isolated strains FY2 and FY3

圖2 FY3株16S r RNA PCR 產物測序后拼接序列Fig.2 Splice sequences after sequencing of 16S r RNA PCR products of FY3 strains

2.4 動物回歸及致病力測定試驗

對6株分離菌株進行動物回歸及致病力測定試驗,將1 m L 濃度為1.0×106CFU/m L 的各分離菌株通過肌肉注射方式注入10月齡健康青年水貂的體內,在14 d內觀察各組試驗動物的死亡情況和發病癥狀。結果表明,6株菌所攻毒水貂在5 d后不同時間內,感染水貂發熱、精神沉郁,體溫高達40℃以上;呼吸困難,并出現急性死亡,不同分離菌株導致水貂死亡比例不同(表2)。取肺組織涂片和肝組織印片進行革蘭氏染色后顯微鏡下觀察,可見革蘭氏陰性桿菌,單個或成對存在,對其再進行生化試驗,結果與表1鑒定結果一致,符合肺炎克雷伯桿菌特征。

表2 6株可疑肺炎克雷伯桿菌分離株動物回歸試驗結果Table 2 Animal regression test results of 6 suspected Klebsiella pneumoniae isolates

以上不同強毒分離菌株在1.0×106CFU/m L時,肌肉注射后可引起20%～100%的水貂死亡。其中FY3和FY4毒力顯著高于其他分離株。

2.5 強毒分離株對易感水貂最小致死量測定結果

取FY3、FY4毒株的普通肉湯培養液,分別稀釋成1.0×105、2.5×105、5.0×105、1.0×106、1.5×106CFU/m L并接種10月齡健康易感青年貂,在14 d內,5.0×105CFU/m L以上濃度時可引起全部接種水貂死亡(表3)。通過表3可以看出,FY3即ZC1108 株(2011 年分離自山東諸城的毒株)的最小完全致死量為5.0×105CFU/m L。

由表3還可看出,FY3和FY4分離株的最小完全致死劑量均為5.0×105CFU/m L,但FY4致死所需時間較長。另外幾個分離株因致死水貂死亡數量或時間較長,未進行最小完全致死劑量研究。因此ZC1108株為所有分離株中致病力較強的菌株,故可能具有較好的免疫原性。

表3 分離株FY3和FY4不同感染量對易感水貂致死率試驗結果Table 3 Experimental results of different infection doses of isolates FY3 and FY4 on mortality of susceptible mink

2.6 強毒分離株的免疫原性試驗結果

將確定的ZC1108分離株做成20%氫氧化鋁膠佐劑滅活疫苗,將10月齡健康易感青年貂20只分為4 組,每組5 只,分別皮下注射疫苗1.0 m L(細菌含量分別為1.0×109CFU/m L、2.0×109CFU/m L、3.0×109CFU/m L 和4.0×109CFU/m L)。另取5只健康水貂注射同量PBS作為非免疫對照。接種21 d后,每只水貂各肌肉注射ZC1108株菌液1.0 m L(1.0×106CFU/m L),觀察14 d。結果發現對照水貂全部死亡,免疫水貂健活情況詳見表4。

從表4可以看出,ZC1108株的最小有效免疫劑量為2.0×109CFU,在該劑量下被免疫水貂即可實現100%的保護率,保護效果顯著優于1.0×109CFU 免疫劑量。

表4 ZC1108分離株免疫原性及保護試驗結果Table 4 Immunogenicity and protective test results of ZC1108 isolate strain

3 討論

2019年中國水貂取皮1 169萬張左右,最大省份為山東省,其次為遼寧、黑龍江、河北等省市,都具有很大的養殖規模。水貂養殖受到各種傳染病威脅,主要為病毒病和細菌病,細菌病中以綠膿桿菌為主要威脅病原[2,6-7],但近些年也有少部分受肺炎克雷伯桿菌感染威脅,或者見于少部分是兩種菌以上混合感染的病例[8-10]。此外,豬等家畜也有肺炎克雷伯桿菌感染的病例,相關團隊也對該菌相關特性進行了分析[11-12]。筆者從自然發病水貂出血性肺炎沒有銅綠假單胞菌的病例病料中分離到6株可疑肺炎克雷伯桿菌,經系統的生化試驗、基因序列、致病性等鑒定為肺炎克雷伯桿菌。從分離結果看肺炎克雷伯桿菌可能是這些水貂病例肺部感染和血液感染的主要致死原因。肺炎克雷伯桿菌在醫學臨床上也能引起人的肺炎、菌血癥、尿路感染等,屬于人獸共患病病原,其致病性越來越強。因此,研制針對肺炎克雷伯桿菌的疫苗非常必要,先前也有對包含克雷伯桿菌在內的亞單位苗、聯苗進行相關研究[13-14],筆者對水貂進行的疫苗免疫可行性分析結果獲得了較好的預期前景。

從動物回歸試驗、最小致死劑量和致病力及免疫原性試驗的結果可見,分離的FY3(ZC1108)和FY4株致病性最強,攻毒1 m L 濃度為1.0×105CFU/m L 的菌液均能引起水貂發病,5.0×106CFU/m L 以上均可導致死亡;其中采用FY3分離株制備的疫苗免疫動物后,再用1.0×106CFU/m L攻毒后可達到5/5健活,免疫所需細菌數量為2.0×109CFU/m L 以上時就可達到很好的保護效果。因此,該毒株適合于作為肺炎克雷伯菌疫苗的候選株,可為水貂克雷伯桿菌預防提供潛在疫苗株,進一步考慮多價苗的研發,對防止動物和人類感染的源頭防控有積極作用。