IFI35 介導細胞凋亡抑制新城疫病毒增殖的分子機制研究

賈燕青仇薪鑫張 蓉楊增岐

(1.楊凌職業技術學院動物工程分院/動物疫病防控陜西省高校工程研究中心,陜西楊凌 712100;2.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100)

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是嚴重危害全球養禽業的重要病原之一,其強毒能夠導致家禽90%以上的死亡,給養禽業帶來了巨大的經濟損失[1-2]。研究病毒與宿主之間的作用關系,可以有效幫助闡明病毒感染及宿主免疫反應的關系,有利于幫助新城疫防控和新疫苗研發[3-5]。高通量測序技術的快速發展促進了NDV 感染時對宿主基因變化規律的研究,本研究前期通過轉錄組測序全面深入了解NDV 感染無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)雞胚后內臟組織mRNAs表達譜的變化,比較不同毒力NDV 毒株對雞胚組織基因表達的影響,并對NDV 感染引起的差異表達基因進行功能注釋和生物學通路分析,篩選與天然免疫反應相關的關鍵基因及通路[3-4]。

在干擾素(Interferon,IFN)相關差異表達基因中,選擇一些基因進行深入研究,發現干擾素誘導蛋白35(Interferon induced protein 35,IFI35)抗NDV 效果較好,因此對該分子進行深入研究并發現該分子可以通過增強IFNs表達來發揮抗NDV 作用。然而有研究報道發現,不同的基因可以通過改變細胞生長狀態來影響NDV 在細胞中的增殖[6-8],本研究通過探索IFI35基因在抗NDV 感染過程中是否還存在除了干擾素通路以外的其他途徑來抑制病毒的增殖,闡明IFI35抗NDV 感染的其他分子機制,以期為NDV 的防治提供新的靶點與思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 雞成纖維細胞系(DF-1)、NDV 強度株F48E9和弱毒株La Sota-GFP均來自于西北農林科技大學動物醫學院傳染病實驗室。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶、高保真酶Prime STAR MAX為寶生物工程(大連)有限公司產品;反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒為北京GenStar公司產品;質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品;改良Eagle培養基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium,DMEM)細胞培養液和胎牛血清為GIBCO 公司產品;TurboFect轉染試劑盒購自Thermo Scientific公司;鼠源HA 單抗、GAPDH 單抗、羊抗鼠IgG-HRP為天津三箭生物公司產品;鼠源Flag單抗、兔源HA 多抗、羊抗鼠綠色熒光抗體和羊抗兔紅色熒光抗體為生工生物工程(上海)股份有限公司產品;聚二偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜為美國GE 公司產品;凋亡檢測試劑盒為北京康為世紀生物科技有限公司產品;其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 按照RNAiso Plus提取細胞或組織總RNA,按照StarScript ⅡFirst-strand cDNA Synthesis Mix試劑盒進行反轉錄。根據2×RealStar Green Power kit說明進行實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析,以28S 為內參,檢測目的基因的表達,引物序列見表1。反應體系(20μL)為:cDNA 1μL,上游引物(10μmol/L)0.4μL,下游引物(10μmol/L)0.4μL,2×RealStar Green Fast Mixture 10μL,dd H2O 8.2μL;混勻后,進行PCR 反應,反應程序為:95 ℃,2 min;95 ℃,15 s,60 ℃,30 s,45個循環。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 基因擴增、質粒構建及細胞轉染 根據RNA-Seq測序結果及NCBI數據庫中IFI35基因的預測序列(GenBank登錄號:XM_418132.5)設計擴增雞源IFI35基因片段的引物。收集F48E9感染的雞胚成纖維原代細胞(Chicken embryo fibroblast,CEF),提取RNA 并進行反轉錄,合成的cDNA 用于擴增IFI35基因片段。使用高保真酶Prime STAR MAX 進行擴增,反應程序為95 ℃,預變性5 min;95 ℃15 s,55 ℃15 s,72 ℃45 s,40個循環。PCR 產物測序正確后,連接至p CMV-3HA 載體上,構建p CMV-3HA-IFI35 質粒。 以同種方法成功構建p CAGGS-Flag-IFI35等質粒,并經雙酶切及測序進行驗證。

將狀態良好的DF-1 細胞生長于24 孔板中(105/孔),待細胞生長至80%融合時,進行質粒轉染,按照TurboFect轉染試劑說明進行細胞轉染。轉染24 h 后,收集細胞,檢測目的基因的m RNA 和蛋白表達變化。

1.2.3 NDV 感染細胞及病毒滴度測定 對病毒增殖主要采用半數組織感染劑量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)和熒光密度進行測定。DF-1細胞在96孔或24孔板培養24 h,將收集的待測病毒上清進行10倍連續稀釋,以100 μL/孔或300μL/孔依次加入96孔板或24孔板中。在病毒感染后連續5 d進行觀察直至沒有新的病變出現,統計并記錄每孔病毒的感染情況。TCID50用Reed-Muench方法進行計算,平均每個視野下熒光強度計算參考文獻所用方法[9]。

1.2.4 蛋白免疫印跡 DF-1細胞均勻鋪于24孔細胞板中,待單層細胞生長至85%融合時進行質粒轉染。將p CMV-3HA-IFI35、p CMV-3HA、p CAGGS-Flag-IFI35 及p CAGGS 質粒進行單轉,每種質粒各轉1μg/孔,24 h 后收集蛋白樣品,用蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測IFI35表達量。用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution,PBS)將細胞洗滌3遍,在細胞中加入含苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的RIPA(Radio immunoprecipitation assay)裂解液,然后置于冰上充分裂解30 min。將細胞裂解液收集到1.5 m L 離心管中,4 ℃、12 000 r/min 離心10 min,收取上清加入5×蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min。制備濃度為12%SDS-PAGE 的分離膠,每孔加入等量蛋白,在80 V 進行電泳30 min,當染料跑出濃縮膠時,120 V 繼續電泳,直到樣品電泳至膠底即可結束電泳。將PVDF膜在甲醇中浸泡20 s,取出電泳膠,按順序裝好轉膜夾,100 m A 恒流電泳1 h。電泳結束,將PVDF膜浸泡在濃度為10%的脫脂奶粉中,室溫封閉2 h。封閉結束后,將膜放入一抗孵育液中,4 ℃過夜孵育。用TBS+Tween緩沖溶液(Tris-HCl and Tween,TBST)清洗PVDF膜5次,每次10 min。結束后,在搖床上緩慢孵育二抗1 h,用TBST 緩沖液清洗PVDF膜5次,每次10 min。洗滌結束后,在蛋白曝光儀上進行曝光,并記錄結果。

1.2.5 細胞凋亡檢測 待DF-1細胞生長密度達80% 左右時,用Turbofect 轉染pCAGGSFlag-IFI35與Vec質粒,轉染24 h 后,一組接種0.1MOI F48E9,另一組不接毒,每組3 個重復,并設置空白對照組。接毒24 h 后按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒進行檢測樣品準備。用不含乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)的胰酶消化細胞,1 000 g離心3 min,棄上清,用預冷PBS重懸細胞,重復清洗細胞兩次;用Binding Buffer重懸細胞,調節細胞密度約為1×106/m L;取100μL細胞懸液,加5μL Annexin V-FITC和10μL 碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液;避光孵育15 min,流式細胞儀進行分析。第二象限顯示晚期凋亡細胞,第四象限顯示早期凋亡細胞。同時利用RT-qPCR 方法檢測IFI35對線粒體凋亡相關基因m RNA 水平的影響,主要包括p53、Caspase3和FasL,引物如表1所示。

1.2.6 統計學分析 試驗均進行3次生物學重復,用GraphPad prism 5進行數據分析及作圖。結果采用student’sttest進行顯著性檢驗,數值以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 mRNAs表達差異分析及RT-qPCR 結果驗證

前期NDV 轉錄組測序研究中發現,F48E9感染后獲得2 035個差異表達基因,其中1 190個基因的表達量上調,845個基因的表達量下調;La Sota感染后獲得1 604 個差異表達基因,其中992個基因的表達量上調,612個基因的表達量下調;La Sota感染組與F48E9 感染組比較,獲得1 028個差異表達基因,其中360 個基因的表達量上調,668 個基因的表達量下調。利用RTqPCR 技術對隨機選取的10個差異表達基因進行驗證,熒光定量PCR 結果與轉錄組測序結果相似,干擾素刺激基因12(Interferon-stimulated gene 12-2,ISG12-2)、IFI35、莫羅尼白血病病毒10(Moloneyleukemiavirus 10,Mov10)、遺傳和生理學實驗室蛋白2基因(Laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)、干擾素調節因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF3)、黏病毒抵抗蛋白(Myxovirus resistance,Mx)基因、寡腺苷酸合成酶樣蛋白(Oligonucleotide synthaselike protein synthetase,OASL)基因、三重基序蛋白25(Tripartite motif-containing protein 25,TRIM25)基因、組織型轉谷氨酰胺酶(Transglutaminase type 2,TGM2)及8號染色體開放閱讀框4 抗體(Chromosome 8 open reading frame,C8ORF4)均為表達上調差異基因且在強弱毒株感染時有差異(圖1),這些驗證結果表明測序結果比較可靠,可用于數據分析。

圖1 RNA-Seq測序及RT-qPCR 驗證分析Fig.1 Analysis of RNA-Seq and RT-qPCR verification

2.2 IFI35 對NDV增殖的影響

選取部分差異表達基因,將其克隆連接至載體上,進行NDV 感染研究,這些基因包括IFI35、ISG12-2、C2orf40、C8orf4、TCF21和TIRM25。在質粒轉染24 h后接種La Sota-GFP病毒,并在接毒后12 h、24 h、36 h和48 h觀察La Sota-GFP感染細胞熒光強毒,結果發現IFI35抗NDV 效果較好(圖2),因此對該分子進行深入研究。

圖2 基因過表達對La Sota-GFP增殖的影響Fig.2 Effect of gene overexpression on the proliferation of La Sota-GFP

構建IFI35過表達重組質粒,并用western bolt進行檢測,發現構建的質?？梢杂行г黾覫FI35的表達。在DF-1細胞中過表達IFI3524 h(圖3),再感染F48E9或La Sota-GFP后,取接毒后9、12、24、36和48 h樣品檢測病毒增殖,發現IFI35過表達可以有效地抑制NDV 的復制,在接毒后9、12、24、36和48 h La Sota-GFP分別被抑制2.5、5.03、5.83、9.17和6.67倍,F48E9分別被抑制3.33、10、10、7.5和9.17倍,以上結果表明IFI35可有效抑制NDV 的增殖。

圖3 過表達IFI35 可抑制NDV增殖Fig.3 Overexpression of IFI35 inhibit the proliferation of NDV

2.3 IFI35 抗NDV機制研究

為了闡明IFI35抗病毒機制,在DF-1 細胞中過表達IFI3524 h后感染NDV 病毒,通過流式細胞術分析細胞凋亡情況。結果發現,過表達IFI35可以促進細胞凋亡,IFI35過表達時可顯著增強NDV 誘導的DF-1細胞的凋亡,早晚期凋亡細胞百分比約是對照組的2倍(圖4-A),進一步驗證了NDV 可引起細胞凋亡。利用RTqPCR 方法檢測m RNA 水平,結果發現過表達IFI35可促凋亡基因p53、Caspase3和Fas L顯著上調,這些數據表明,過表達IFI35可以促進細胞凋亡和NDV 誘導的細胞凋亡,IFI35可以通過激活細胞凋亡通路來抵抗NDV 的增殖。

圖4 IFI35 過表達時能促進細胞凋亡Fig.4 Overexpressed IFI35 could promote cell apoptosis

3 討論

本試驗篩選了NDV 感染后的差異表達基因進行抗病毒研究,發現IFI35基因在抗NDV 感染中效果較好,因此對該基因進行了深入的分析和研究。IFI35是1994年在IFNγ處理的HeLa細胞中首次發現的[10],隨后IFI35序列在鼠、牛及魚類相繼報道[11-13],到目前為止,IFI35的分子功能僅在哺乳類和甲骨魚中報道,IFI35對病毒增殖的影響研究較少,據報道IFI35可通過直接與豬流感病毒(H3N2)的病毒蛋白NS1相互作用來抑制病毒的復制,使視黃酸(維甲酸)誘導基因蛋白Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)從IFI35介導的K48連接泛素化和降解中釋放出來,產生抗病毒作用,而IFI35不能與禽流感病毒(H7N9)NS1蛋白作用,導致在H7N9感染時發揮相反的作用[14]。IFI35可以通過保持RIG-I的磷酸化并對其進行泛素化降解達到天然免疫反應信號通路的負調節作用,進而促進VSV病毒的復制[12]。在本研究中,過表達IFI35可以抑制F48E9和La Sota的增殖,這與抑制牛泡沫病毒(Bovine foamy virus,BFV)和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)增殖的報道相似[11,15-16]。眾所周知,在雞上缺少RIG-I分子,這可能是導致IFI35在VSV 和NDV 感染中有差異的原因,雖然黑色素瘤分化相關基因5(Melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)與RIG-I的部分功能相似,但是他們在對病毒應答和降解方式上還是存在著差異[16]。IFI35是一種IFN誘導基因,筆者已經證明了IFI35與IFN 之間的表達變化,發現IFI35可以調節IFNs的產生,進而發揮抗NDV 的作用[17]。

細胞凋亡是由多種基因調控的一種程序性細胞死亡方式,也是宿主抵抗病毒感染的一種防御策略[18]。在本研究中,筆者發現雞源IFI35過表達后,在凋亡檢測中早晚期凋亡細胞明顯增多,這表明IFI35可以促進細胞凋亡,也可以促進NDV感染誘導的細胞凋亡。在從m RNA 水平進行檢測,結果發現無論是否有NDV 感染,都可以引起FasL表達量增加,而在NDV 感染時可促進p53和Caspase3表達增加。FasL作為細胞膜表面分子,過表達時可觸發靶細胞內部凋亡程序,引起靶細胞程序性凋亡,研究發現NDV V 蛋白過表達可抑制該基因的表達,從而抑制細胞凋亡[7]。p53基因可以抑制腫瘤發生,也能促進細胞凋亡,研究表明當過量表達時可以抑制NDV 和IBDV 的增殖[19]。Caspase3基因是引起細胞凋亡的重要調節基因,當線粒體凋亡途徑激活后,可改變線粒體的膜通透性,導致Cyt c等大分子蛋白質釋放,可以激活Caspase3/Caspase9,最終導致細胞凋亡發生[20]。ISG12(1)過表達可以引起Bak、Cyt c和Caspase3/Caspase9表達增加,通過細胞凋亡方式,來抑制NDV 的增殖[21]。在HK-2細胞中,miR-146b-5p可靶向IFI35介導JAK1/STAT1信號抑制炎癥反應和細胞凋亡,IFI35過表達可促進LPS引起的炎癥反應和細胞凋亡,而敲低IFI35可導致相反的趨勢[22]。本研究結果初步表明,IFI35可以通過促進細胞凋亡來抑制NDV的增殖,但是具體的激活路徑還需要進一步再深入研究,為深入了解NDV 與宿主的相互作用提供新的見解,也為NDV 防治提供新的靶點。

4 小結

利用高通量測序技術對NDV 感染的雞胚內臟組織轉錄譜進行測序分析,與對照組相比,F48E9感染組和La Sota感染組分別有2 035和1 604個差異表達基因,對部分差異表達基因進行抗NDV 增殖研究,雞源差異表達基因IFI35抗病毒效果較好,除了IFN 信號通路抑制病毒增殖以外,本研究發現IFI35可顯著促進細胞凋亡,促進凋亡相關基因表達增加,對NDV 增殖發揮抑制作用,這些研究豐富了宿主抗NDV 的分子機制研究,也為新城疫防治和疫苗研發提供新的思路。