基于蛋白質(zhì)組學的肝癌復發(fā)預警模型的構建及應用

陳成 項蕭楠 劉治坤 王建國 徐驍

(1 浙江大學醫(yī)學院附屬湖州醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 湖州 313000；2 浙江大學醫(yī)學院;3 浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科;4 浙江省腫瘤融合研究與智能醫(yī)學重點實驗室;5 浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院肝膽胰外科)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)具有高發(fā)病率、高死亡率的特點，5年總體生存率不足20%[1]。手術切除是HCC的主要治療手段[2]，但術后5年復發(fā)率高達70%，嚴重影響患者預后生存。準確預測HCC術后患者預后并及時早期干預，可以有效延長HCC患者的生存時間。微血管侵犯(MVI)是HCC主要轉(zhuǎn)移方式之一[3-4]，是HCC患者術后復發(fā)的重要危險因素，常常與預后不良相關[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)FAM123B可通過Akt信號通路誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進HCC轉(zhuǎn)移[7]。另有研究顯示CR1和NFκB/p65可形成促進HCC侵襲的正反饋環(huán)[8]，這些因子也許可以作為預測切除術后HCC復發(fā)的生物標志物，但目前仍缺乏具有較高靈敏度和特異度的MVI分子標志物的報道，因此探索新型HCC的MVI標志物，對其術后復發(fā)的預警具有重要意義。蛋白質(zhì)組學分析借助于串聯(lián)質(zhì)譜標記及同位素標記相對和絕對定量技術，目前已廣泛用于新的腫瘤生物標志物研究探索之中[9-10]。本研究通過蛋白質(zhì)組學技術分析MVI相關的蛋白標志物，探討基于蛋白質(zhì)組學的HCC復發(fā)預警模型對HCC患者預后預測的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 HCC患者腫瘤組織樣本的收集和蛋白質(zhì)組學分析

收集浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院術后病理確診為HCC患者的腫瘤組織樣本6例，其中MVI陽性患者3例，MVI陰性患者3例，MVI的診斷依據(jù)術后病理報告結果。樣本的蛋白質(zhì)組學檢測和分析委托北京博奧生物科技有限公司進行，按照串聯(lián)質(zhì)譜標簽試劑盒(90064,Thermo公司，美國)的說明進行樣品制備和標記。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術分析獲得腫瘤組織中蛋白的平均表達水平，將P<0.05及Log2差異倍數(shù)>1.20或<0.83蛋白質(zhì)定義為MVI陽性與陰性腫瘤組織的顯著差異表達蛋白。

1.2 顯著差異表達蛋白與HCC患者預后相關性的分析

HCC患者臨床信息和腫瘤組織與癌旁組織的mRNA表達譜數(shù)據(jù)通過TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cbioportal.org/)[11]下載，隨后使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)[12]分析顯著差異表達蛋白在基因表達水平與HCC患者生存預后的相關性。

1.3 HCC組織芯片制作

收集浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2015年1月—2018年10月病理確診為HCC患者的腫瘤組織及其癌旁正常組織樣本200例，委托上海芯超生物科技有限公司制作組織芯片并命名為TMA-1，同時收集這200例HCC患者的生存信息。

1.4 顯著差異表達蛋白的免疫反應評分測定及其與HCC患者預后的相關性分析

采用免疫組織化學方法檢測顯著差異表達蛋白在TMA-1中的表達情況，按照免疫組織化學染色試劑盒的操作要求對TMA-1進行染色。將4 μm組織芯片TMA-1徹底脫蠟，并在適當?shù)木彌_液中進行熱抗原修復。然后在室溫下采用0.5%過氧化氫孵育20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用正常山羊血清在37 ℃下阻斷40 min，然后與適當稀釋的一抗在4 ℃下孵育18 h。抗體孵育后，用TBST緩沖液沖洗3次(每次5 min)。然后，用HRP偶聯(lián)二抗(購買自中國ZSGB-Bio公司)在37 ℃下孵育30 min。TBST徹底清洗后，對載玻片進行DAB染色和蘇木精重新染色。用相同稀釋倍數(shù)的鼠或兔IgG替代一抗獲得陰性對照切片。

通過半定量方法對腫瘤細胞進行免疫反應評分(IRS)[13]。IRS為細胞染色強度(0～3分)與陽性百分比(0～4分)的乘積[14]。IRS大于6分被定義為蛋白高表達，采用電話隨訪獲取200例HCC患者預后信息，采用Kaplan-Meier方法分析顯著差異表達蛋白與HCC患者預后相關性。

1.5 復發(fā)預警列線圖模型構建及臨床驗證

對TMA-1中200例HCC患者的臨床病理特征基線和顯著差異表達蛋白進行單因素Cox回歸分析，對單因素分析中P<0.05的因素進行多因素COX回歸分析，獲得HCC患者術后復發(fā)的獨立危險因素。采用所有獨立危險因素構建復發(fā)預警列線圖，并根據(jù)列線圖計算風險評分，以風險評分中位數(shù)為截斷值將患者分為高風險組和低風險組，比較兩組的生存預后情況。采用自助抽樣驗證方法對復發(fā)預警模型進行臨床驗證。

1.6 統(tǒng)計分析

應用R軟件(版本3.6.3)和SPSS 21.0軟件進行分析。采用Kaplan-Meier進行生存分析。采用COX比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。采用一致性指數(shù)(C-index)評價列線圖的預測能力，校準曲線評價列線圖的預測符合度，采用受試者工作特征(ROC)曲線評價列線圖模型的預后預測效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HCC患者腫瘤組織樣本的蛋白質(zhì)組學分析

蛋白質(zhì)組學分析結果顯示，與MVI陰性腫瘤組織對比，MVI陽性腫瘤組織中顯著上調(diào)蛋白16個，顯著下調(diào)蛋白23個。

2.2 顯著差異表達蛋白與HCC患者預后的相關性分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載HCC患者數(shù)據(jù)，采用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析上述39個顯著差異表達蛋白在HCC組織與癌旁組織中基因表達水平的差異，并進一步分析這些顯著差異表達蛋白的基因表達水平與HCC患者預后相關性。結果顯示在HCC組織中共7個蛋白表達基因(U2SURP、RFC4、NUTF2、BCAP31、CRELD2、EEF1E1和GBA2)顯著上調(diào)，3個蛋白表達基因(ADH4、HRG、FABP1)顯著下調(diào)。進一步生存分析的結果顯示，HCC組織之中ADH4和HRG高表達的患者的總生存率(OS)顯著高于低表達的患者(P<0.05)，而HCC組織中U2SURP、RFC4以及NUTF2高表達的患者OS顯著低于低表達的患者(P<0.05)，上述5個顯著差異性表達蛋白的基因表達水平與患者的預后具有密切相關。

2.3 顯著差異表達蛋白的IRS及其與HCC患者預后的相關性分析

采用免疫組織化學方法在TMA-1中對上述5個顯著差異表達蛋白進行染色，結果顯示(表1)，U2SURP、RFC4和NUTF2在腫瘤組織中表達顯著高于癌旁組織(t=7.17～15.18，P<0.001)，而ADH4的表達顯著低于癌旁組織(t=-19.18，P<0.001)。HRG在腫瘤組織和癌旁組織中陽性百分比較低，分別為5%和4%，故后續(xù)沒有對其進行進一步分析。

采用Kaplan-Meier方法對上述4個顯著差異表達蛋白與HCC患者預后進行相關性分析。結果顯示，腫瘤組織中ADH4高表達患者的OS和無復發(fā)生存率(RFS)顯著高于ADH4低表達患者，腫瘤組織中U2SURP低表達患者的OS和RFS顯著高于U2SURP高表達患者(P<0.05)。而NUTF2和RFC4的表達與患者預后無顯著相關性(P>0.05)。

表1 顯著差異表達蛋白的IRSTab.1 IRS of significantly differentially expressed proteins

2.4 復發(fā)預警列線圖模型構建及臨床驗證

對TMA-1中200例HCC患者的臨床病理特征基線指標和顯著差異表達蛋白進行單因素COX回歸分析，結果表明腫瘤直徑≥5 cm(HR=2.214，95%CI=1.342～3.653)，年齡>50歲(HR=1.095，95%CI=1.016～1.227)，AFP≥20 μg/L(HR=2.347，95%CI=1.575～3.499)，MVI陽性(HR=2.044，95%CI=1.434～2.916)，腫瘤分化程度為中-低分化(HR=1.709，95%CI=1.200～2.433)，U2SURP高表達(HR=1.880，95%CI=1.307～2.706)以及ADH4低表達(HR=2.225，95%CI=1.442～3.442)是HCC術后復發(fā)的危險因素(P<0.05)，性別和腫瘤數(shù)目對HCC術后的復發(fā)無顯著影響(P>0.05)。將上述因素納入多因素COX回歸分析并用森林圖展示，結果顯示U2SURP高表達、ADH4低表達、腫瘤直徑≥5 cm和AFP≥20 μg/L是HCC患者術后復發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)，詳見圖1A。以這4個參數(shù)構建列線圖模型并在HCC患者(n=200)中驗證(圖1B)，結果顯示，HCC患者RFS預測值一致性指數(shù)(C-index)為0.71(95%CI=0.67～0.76)，見圖2A、B。高風險組和低風險組的預后生存分析結果顯示，低風險組的RFS和OS顯著高于高風險組(P<0.05)(圖2C和D)。ROC曲線顯示，列線圖預測HCC患者術后1、3年RFS的曲線下面積(AUC)分別為0.75(95%CI=0.68～0.81)和0.76(95%CI=0.69～0.83)，見圖3。上述結果顯示該復發(fā)預警列線圖模型可以預測HCC復發(fā)情況。

A：風險比森林圖，B：HCC復發(fā)預警列線圖圖1 HCC復發(fā)預警列線圖Fig.1 Recurrence warning nomogram of hepatocellular carcinoma

A、B分別為HCC患者1年和3年RFS預測的校準曲線，C、D分別為HCC患者RFS和OS的Kaplan-Meier分析圖2 HCC患者的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier analysis of hepatocellular carcinoma

圖3 HCC患者的ROC分析Fig.3 ROC analysis of hepatocellular carcinoma

3 討 論

HCC是原發(fā)性肝癌中最常見的一種病理類型，約占原發(fā)性肝癌的75%～85%[15]。由于HCC早期診斷困難且術后復發(fā)率高，患者的預后生存情況普遍不理想[16]。以往研究表明，HCC患者的MVI陽性與預后不良顯著相關[17]，但是目前尚無理想的MVI分子標志物可應用于臨床實踐。蛋白質(zhì)組學研究可比較不同細胞、組織間蛋白質(zhì)表達的異同，有助于探索疾病診斷標志物和治療靶點，具有重要應用價值。

本研究運用蛋白質(zhì)組學技術揭示了MVI陽性的HCC中差異表達的蛋白分子標志物，共篩選出16個上調(diào)的差異表達蛋白和23個下調(diào)的差異表達蛋白。初步采用TCGA數(shù)據(jù)庫去驗證上述39個差異表達蛋白的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)其中有10個差異表達蛋白在基因水平存在顯著差異，其中ADH4、U2SURP等5個差異表達蛋白與患者生存預后顯著相關，并進一步進行了免疫組織化學驗證和預后生存分析。

ADH4是ADH家族成員，可作為多種底物的代謝酶。ADH4在卵巢癌、喉癌、食管癌等惡性腫瘤中異常表達，并且參與了大部分癌癥相關生理過程[18-19]。有研究報道，與正常肝臟相比，HCC組織中ADH4的表達顯著下調(diào)[20-22]，提示ADH4和乙醇代謝失調(diào)可能參與了HCC的發(fā)生，HCC組織中ADH4低表達與患者較低的OS相關，ADH4表達水平可以作為患者OS的獨立預測因子[20]。然而，HCC中ADH4與MVI的相關性尚無研究報道。本研究結果顯示，ADH4低表達與MVI陽性顯著相關，并且ADH4高表達HCC患者OS和RFS顯著高于低表達患者。

研究示U2SURP是U2 snRNP相關蛋白[23]，其與RBM17以及CHERP相互作用，調(diào)節(jié)彼此的穩(wěn)定性，并調(diào)控下游RNA結合蛋白[24]。在癌癥研究領域，U2SURP參與了結腸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并對患者的預后有重要影響[25]。然而，尚無研究報道U2SURP與HCC之間關系。本研究發(fā)現(xiàn)U2SURP高表達與MVI陽性相關，且U2SURP低表達HCC患者OS和RFS顯著高于高表達患者，提示U2SURP可能是HCC術后復發(fā)預警的分子標志物。

本研究進一步建立了包含U2SURP、ADH4、腫瘤直徑以及AFP值4個參數(shù)的列線圖模型，并在HCC肝切除隊列中進行驗證，結果顯示低風險組患者的RFS和OS顯著高于高風險組患者。近年來，關于HCC患者的預后相關特征和生存風險模型已有相關研究報道。如，有研究通過多組學分析建立了一個8基因模型(ACADS、HSD17B13、PON3、AMDHD1、CYP2C8、CYP4A11、SLC27A5以及CYP2E1)來預測HCC患者的預后情況，該模型之中基因的高表達與較低的HCC分期/風險評分相關[26]。LI等[27]亦建立了基于年齡、性別、分期和6個基因特征等4個獨立因素的列線圖模型來預測HCC術后患者的OS。上述研究可能有助于臨床醫(yī)生對HCC術后患者的個體化治療方案進行選擇。然而，這些預測預后的模型在很大程度上都是依賴于從公共數(shù)據(jù)庫中檢索得到的數(shù)據(jù)，這些模型是否能夠應用于臨床尚無定論。因此，本研究所建立的預后模型可能成為HCC術后患者OS和RFS預測的可靠工具，或有助于臨床醫(yī)生篩選HCC術后高危復發(fā)患者并選擇合理的個性化治療方案。

本研究中也存在著一定的局限性：①ADH4和U2SURP兩個蛋白標志物在HCC的MVI中的具體機制尚需進一步探究；②本研究構建的復發(fā)預警列線圖模型采用了內(nèi)部驗證，后續(xù)需收集多中心大樣本的數(shù)據(jù)進一步進行驗證。

綜上，本研究建立的模型整合了MVI相關的蛋白標志物(ADH4和U2SURP)、腫瘤直徑和AFP值，經(jīng)HCC肝切除隊列驗證后具有良好的預后預測效果，對HCC術后患者的復發(fā)預警和早期干預可能具有重要的參考價值。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：陳成、王建國、徐驍參與了研究設計；陳成、項蕭楠、劉治坤、王建國、徐驍參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byCHENCheng,WANGJianguo, andXUXiao. The manuscript was drafted and revised byCHENCheng,XIANGXiaonan,LIUZhikun,WANGJianguo, andXUXiao. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.