有機(jī)化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)：“一鍋法”合成黃酮醇*

蒲 祥，張喻涵，蘭羽秋，楊勝男，胡海鵬，王廣途，王晗光，黃乾明

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，四川 雅安 625014)

目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)高校開(kāi)設(shè)的有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)多注重于讓學(xué)生掌握基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)原理與基本操作技能，有機(jī)物制備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及1-溴丁烷、乙酸乙酯、乙酰苯胺、1-苯乙醇等類(lèi)別物質(zhì)的制備[1-3]。而關(guān)于有機(jī)物制備的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目較少，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)與農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等行業(yè)的科研或生產(chǎn)實(shí)際結(jié)合不夠緊密，不利于農(nóng)、林、動(dòng)、醫(yī)等專(zhuān)業(yè)學(xué)生在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程學(xué)習(xí)期間培養(yǎng)從事行業(yè)有機(jī)化學(xué)研究的興趣[4]。因此，有必要有計(jì)劃地將有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行更新。近年來(lái)，現(xiàn)代化測(cè)試儀器和新的合成方法不斷引入基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，實(shí)驗(yàn)類(lèi)型逐步向綜合訓(xùn)練型和科學(xué)研究型發(fā)展[5]。部分師范類(lèi)和化工類(lèi)院校相繼開(kāi)發(fā)了一些綜合性有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)。例如，孫雨辰等[6]在經(jīng)典重氮偶合實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上新增了硝基還原步驟，制備偶氮類(lèi)化合物；蔣達(dá)洪等[7]在經(jīng)典Robinson增環(huán)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上增加了水相綠色氧化步驟以制備聯(lián)苯類(lèi)化合物。現(xiàn)有有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中未見(jiàn)“一鍋法”合成天然成分黃酮醇的實(shí)驗(yàn)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)將羥醛縮合反應(yīng)與Algar-Flynn-Oyamada(AFO)反應(yīng)結(jié)合，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，既可鍛煉學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)操作技能，讓學(xué)生熟悉AFO反應(yīng)，并鞏固對(duì)羥醛縮合反應(yīng)的理解，又能使學(xué)生熟悉該法在黃酮醇類(lèi)天然成分合成中的應(yīng)用，有效激發(fā)農(nóng)林院校學(xué)生對(duì)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)興趣。

1 實(shí)驗(yàn)背景

黃酮醇是一種天然活性成分，有防治心血管疾病[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]等作用。黃酮醇的制備方法現(xiàn)有4種，即苯并呋喃酮重排法(Auwers法)[11]、Baker-Venkataraman重排環(huán)合法[12-13]、黃酮DMDO氧化法[14]和查爾酮氧化環(huán)化(AFO)法[15]。其中，AFO法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用更為廣泛。傳統(tǒng)的AFO法制備黃酮醇分兩步，在堿性溶液中，以苯乙酮和苯甲醛的衍生物為底物，經(jīng)羥醛縮合制得羥基查爾酮，再將羥基查爾酮氧化環(huán)合生成黃酮醇。該兩步合成方法產(chǎn)生大量橙酮副產(chǎn)物，黃酮醇產(chǎn)率較低，僅有10%～20%。2012年，Gunduz等[16]對(duì)經(jīng)典的AFO反應(yīng)作了進(jìn)一步改進(jìn)，發(fā)展了“一鍋法” AFO環(huán)合法：在氫氧化鈉的甲醇溶液中回流反應(yīng)3 h，冷卻至室溫后，再直接加入氫氧化鈉溶液、過(guò)氧化氫溶液攪拌2～3 h。“一鍋”內(nèi)連續(xù)操作合成了黃酮醇及其類(lèi)似物，產(chǎn)率可達(dá)70%以上。2020年，Xiong等[17]對(duì)“一鍋法”AFO環(huán)合法進(jìn)行再次改進(jìn)，在四氫吡咯催化下回流攪拌24 h合成黃酮醇，產(chǎn)率可達(dá)80%以上，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，且四氫吡咯具有腐蝕性，在操作過(guò)程中存在一定危險(xiǎn)性，不利于本科生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。因此，筆者最終選擇對(duì)Gunduz等[16]合成黃酮醇的方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，將其轉(zhuǎn)化為一個(gè)綜合創(chuàng)新型實(shí)驗(yàn)。改進(jìn)后操作簡(jiǎn)單安全、反應(yīng)現(xiàn)象明顯、產(chǎn)率高，適合運(yùn)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

通過(guò)黃酮醇的“一鍋法”合成，掌握羥醛縮合、氧化成環(huán)等反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作，鞏固羥醛縮合機(jī)理，熟悉AFO人名反應(yīng)涉及的環(huán)氧化-氧化機(jī)理及提高黃酮醇產(chǎn)率的方法；鞏固重結(jié)晶的純化原理和實(shí)驗(yàn)操作；熟悉黃酮醇的制備，啟發(fā)學(xué)生探究不同黃酮醇衍生物的合成；熟悉反應(yīng)進(jìn)程監(jiān)測(cè)、黃酮醇定性鑒別、產(chǎn)品純度判斷，以及運(yùn)用熔點(diǎn)儀、IR和NMR等對(duì)黃酮醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

3 實(shí)驗(yàn)原理

該反應(yīng)是在堿性條件下，苯甲醛、鄰羥基苯乙酮、過(guò)氧化氫之間發(fā)生的連續(xù)羥醛縮合與氧化成環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程為苯甲醛與鄰羥基苯乙酮先在堿性條件下，先經(jīng)羥醛縮合反應(yīng)形成查爾酮中間體。查爾酮中間體不經(jīng)分離，直接加入過(guò)氧化氫及氫氧化鈉溶液進(jìn)行氧化成環(huán)反應(yīng)，終反應(yīng)液調(diào)節(jié)pH至6～7。再加入冰水使黃酮醇充分析出，減壓抽濾、蒸餾水洗滌4～5次，所得固體充分干燥后用乙醇重結(jié)晶即得黃酮醇。合成路線如圖1所示。

4 試劑與儀器

苯甲醛(AR)、鄰羥基苯乙酮(99%)、黃酮醇(>98%)標(biāo)品，購(gòu)于上海阿拉丁股份有限公司。石油醚(AR)、甲醇(AR)、乙醇(AR)、30%過(guò)氧化氫(AR)、乙酸乙酯(AR)、氫氧化鈉(片狀，AR)，購(gòu)于成都科隆化學(xué)品有限公司。薄層色譜硅膠板GF254，購(gòu)于青島海洋化工。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器)、FA2004C電子天平(上海佑科儀器儀表)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器)、ZF-1型三用紫外分析儀(江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造)、F80A斯科茨曼制冰機(jī)(斯科茨曼制冰系統(tǒng)(上海)有限公司)、DHG-9101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器)、SGWR X-4B 顯微熔點(diǎn)儀(上海儀電物理光學(xué)儀器)、8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)、AscendTM 600 MHz核磁共振儀(德國(guó)Bruker)、Agilent Infinity Lab液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫)。

5 實(shí)驗(yàn)操作步驟

5.1 羥醛縮合制備查爾酮

將 0.8 g 氫氧化鈉固體、60 mL 甲醇、1.2 mL 鄰羥基苯乙酮、1.5 mL 苯甲醛，依次加入 250 mL 圓底燒瓶，混合均勻得淡黃色液體。放入磁力攪拌子，將圓底燒瓶置于磁力攪拌器中，75 ℃ 攪拌回流至溶液顏色變?yōu)轷r紅色，可用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(約 3.5 h)。

5.2 AFO反應(yīng)合成黃酮醇

將5.1得到的反應(yīng)液冷卻至室溫后加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 60 mL，再加入30%過(guò)氧化氫 4.8 mL，10 ℃ 下攪拌反應(yīng)約 2.5 h。用TLC法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完成即得鮮黃色反應(yīng)液，隨后向瓶?jī)?nèi)滴加鹽酸溶液(1.2 mol/L)調(diào)節(jié)終反應(yīng)液的pH至6～7。向調(diào)好pH的反應(yīng)液中倒入 30 mL 冰水，攪拌均勻，使黃酮醇充分析出；減壓抽濾，并用蒸餾水洗滌4～5次，充分除鹽，得黃色固體，并置于烘箱中 40 ℃ 干燥，得黃酮醇粗品 1.7674 g，產(chǎn)率為74%。

5.3 黃酮醇的精制

將黃酮醇粗品轉(zhuǎn)移至潔凈的 250 mL 錐形瓶中，逐次向瓶中加入 10 mL 無(wú)水乙醇， 80 ℃ 水浴加熱，并充分振搖。若乙醇加熱至沸騰仍有未溶物時(shí)，繼續(xù)加入 10 mL 無(wú)水乙醇并加熱充分振搖溶解。如此重復(fù)上述操作，待圓底燒瓶中黃酮醇完全溶解后，補(bǔ)加約 15 mL 無(wú)水乙醇(無(wú)水乙醇總用量約 75 mL)。趁熱過(guò)濾除去不溶雜質(zhì)，將濾液趁熱轉(zhuǎn)移至潔凈的 250 mL 錐形瓶中，冰浴冷卻，待晶體析出完全后減壓抽濾；用少量冷乙醇洗滌，所得黃酮醇置 40 ℃ 恒溫烘箱中干燥至恒重，即得精制黃酮醇 1.2018 g，收率為68%。實(shí)驗(yàn)流程與典型實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象如圖2所示。

6 結(jié)果與討論

6.1 黃酮醇合成過(guò)程分析

6.1.1 羥醛縮合反應(yīng)試劑用量的確定

第一步反應(yīng)中，原料苯甲醛沒(méi)有α-H，在濃堿條件下，易發(fā)生Cannizzaro副反應(yīng)(如圖3)。因此為提高查爾酮的產(chǎn)率，在第一步的反應(yīng)試劑用量上應(yīng)考慮兩方面：一是苯甲醛的用量，二是氫氧化鈉的用量。由于苯甲醛會(huì)發(fā)生Cannizzaro副反應(yīng)導(dǎo)致原料損失。為盡量減少鄰羥基苯乙酮的自身縮合，使鄰羥基苯乙酮與苯甲醛充分反應(yīng)，應(yīng)適當(dāng)增加苯甲醛的用量；同時(shí)為盡量減少Cannizzaro副反應(yīng)的發(fā)生，還應(yīng)控制氫氧化鈉的用量，避免反應(yīng)體系pH過(guò)高，產(chǎn)生大量苯甲酸鈉、苯甲醇等副產(chǎn)物。針對(duì)氫氧化鈉固體的用量，設(shè)計(jì)了第一步羥醛縮合反應(yīng)的底物與堿的三組用量比，分別為：n(苯甲醛)∶n(鄰羥基苯乙酮)∶n(氫氧化鈉)=1.5∶1∶3、1.5∶1∶2、1.5∶1∶1(對(duì)應(yīng)的初始pH分別為 13～14、12～13、11～12)，隨后進(jìn)行條件實(shí)驗(yàn)。通過(guò)TLC法比較所得查爾酮的產(chǎn)量與純度。最終確定苯甲醛、鄰羥基苯乙酮和氫氧化鈉最佳物質(zhì)的量比為1.5∶1∶2(pH為12～13)。

6.1.2 AFO反應(yīng)溫度的確定

根據(jù)AFO反應(yīng)的環(huán)氧化-氧化機(jī)理(如圖4)，反應(yīng)溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致橙酮等副產(chǎn)物的生成[18]，應(yīng)將AFO反應(yīng)的溫度控制在室溫(25 ℃)以下。綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本及可操作性，選擇了0、10、15、20、25 ℃ 5個(gè)溫度進(jìn)行第二步AFO反應(yīng)的溫度條件實(shí)驗(yàn)。比較所得黃酮醇的產(chǎn)量、利用TLC法比較黃酮醇的純度，探究AFO反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。最終確定第二步AFO反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度為 10 ℃。

6.1.3 AFO反應(yīng)過(guò)氧化氫用量的確定

第二步AFO反應(yīng)中過(guò)氧化氫的用量十分關(guān)鍵，若過(guò)氧化氫用量過(guò)少，則導(dǎo)致氧化不充分，出現(xiàn)二氫黃酮醇等副產(chǎn)物；用量過(guò)多則導(dǎo)致氧化過(guò)度，也會(huì)增加副產(chǎn)物，影響最終所得黃酮醇的產(chǎn)率和純度。在AFO反應(yīng) 10 ℃ 的最佳反應(yīng)溫度下，設(shè)計(jì)了30%過(guò)氧化氫的3組用量，分別為 4.8 mL(0.047 mol)、5.4 mL(0.053 mol)、6.0 mL(0.059 mol)，隨后進(jìn)行條件實(shí)驗(yàn)。比較所得黃酮醇的產(chǎn)量、利用TLC法比較產(chǎn)品的純度，探究第二步反應(yīng)過(guò)氧化氫的最佳用量。最終確定第二步AFO反應(yīng)過(guò)氧化氫(30%過(guò)氧化氫)的最佳用量為 4.8 mL。

6.1.4 黃酮醇的重結(jié)晶

終反應(yīng)液經(jīng)pH調(diào)節(jié)、產(chǎn)物析出、減壓抽濾、蒸餾水洗滌后所得的黃酮醇粗品中可能存在的雜質(zhì)有副產(chǎn)物2’-羥基查爾酮、二氫黃酮醇、橙酮等。根據(jù)極性由大到小的順序選擇了6種常見(jiàn)溶劑(見(jiàn)表1)。分別將上述6種溶劑作為 0.1 g 粗產(chǎn)品(均來(lái)自于同一次制備的黃酮醇粗產(chǎn)品)的重結(jié)晶溶劑。觀察粗產(chǎn)品在6種溶劑中的溶解情況、冷卻后的析晶情況，并利用TLC法進(jìn)行黃酮醇重結(jié)晶產(chǎn)品及其純度的鑒定，最后計(jì)算黃酮醇收率。實(shí)驗(yàn)表明，乙醇是黃酮醇的最佳重結(jié)晶試劑，見(jiàn)表1。重結(jié)晶溶劑的用量也對(duì)產(chǎn)品的收率和純度起著重要作用。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定在粗產(chǎn)品與乙醇的質(zhì)量體積比為1 g∶45 mL，且同時(shí)進(jìn)行 80 ℃ 水浴加熱和攪拌操作時(shí)，粗產(chǎn)品能較好地溶解，冷卻后析出的晶體最多，純度較高。

6.2 黃酮醇結(jié)構(gòu)分析和表征

6.2.1 熔點(diǎn)、TLC及LC-MS

本實(shí)驗(yàn)制備黃酮醇樣品的熔點(diǎn)為169～170 ℃(文獻(xiàn)值：170～171 ℃)。當(dāng)使用石油醚-乙酸乙酯(體積比6∶1)進(jìn)行TLC時(shí)，其與黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品的TLC對(duì)比結(jié)果如圖5。黃酮醇樣品與標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同，且無(wú)雜質(zhì)點(diǎn)。LC-MS分析結(jié)果顯示，樣品質(zhì)荷比為[M+H]+m/z=239.1、[M+Na]+m/z=261.1(如圖5b)，與標(biāo)準(zhǔn)品(如圖5a)一致。以上結(jié)果均表明在上述實(shí)驗(yàn)條件下成功制備了黃酮醇。

6.2.2 FT-IR

本實(shí)驗(yàn)制備的黃酮醇的IR光譜如圖6所示。其中，3300～3100 cm-1處為黃酮醇C環(huán)3位羥基的νO-H吸收峰，1608 cm-1處為黃酮醇C環(huán)上的νC=O吸收峰，758 cm-1、688 cm-1處為單取代及鄰位雙取代苯環(huán)(B、A環(huán))上的δC-H吸收峰，1560 cm-1、1479 cm-1為苯環(huán)νC=C吸收峰，1130 cm-1、897 cm-1處為黃酮醇C環(huán)1位的νasC-O-C、νsC-O-C吸收峰，1211 cm-1處為黃酮醇C環(huán)3位的νC-O吸收峰。

6.2.3 NMR

本實(shí)驗(yàn)制備所得的黃酮醇核磁共振結(jié)果如圖7所示。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.46(m，3H，a、e、i)，7.91(ddd，1H，c)，7.80(dd，1H，d)，7.78～7.71(m，2H，f、h)，7.71～7.65(m，1H，g)，7.62(ddd，1H，b)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：173.64(c)，155.58(h)，145.04(a)，138.61(b)，133.79(f)，131.22(j)，130.34(m)，128.75(n、l)，127.90(k、o)，125.62(d)，124.67(e)，120.78(i)，118.44(g)。結(jié)果表明，本法成功制備了純度理想的黃酮醇。

7 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)將羥醛縮合反應(yīng)與AFO氧化環(huán)化反應(yīng)結(jié)合，不經(jīng)中間體分離，直接“一鍋法”合成天然活性成分黃酮醇，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)7～8 h，黃酮醇平均產(chǎn)率可達(dá)74%。該實(shí)驗(yàn)既讓學(xué)生鞏固了有機(jī)化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)操作技能，加深其對(duì)羥醛縮合與氧化環(huán)化反應(yīng)機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并熟悉該法在天然活性成分黃酮醇制備過(guò)程中的實(shí)際運(yùn)用；本實(shí)驗(yàn)的原料苯甲醛、鄰羥基苯乙酮，重結(jié)晶溶劑乙醇等都是本科實(shí)驗(yàn)常用的原料，低毒易得，價(jià)格便宜；本實(shí)驗(yàn)還具有操作簡(jiǎn)便，變色現(xiàn)象明顯，產(chǎn)率較高等的優(yōu)點(diǎn)，易于激發(fā)學(xué)生實(shí)驗(yàn)興趣。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)教學(xué)學(xué)時(shí)8學(xué)時(shí)，適于將其開(kāi)設(shè)為農(nóng)林院校有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)的綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)。此外，還可以基于本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)原理進(jìn)行底物拓展，引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計(jì)并制備新型黃酮醇衍生物，提升學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>