激活轉錄因子2對胰腺癌細胞增殖與凋亡的影響

劉宇，李木，孔靜

（中國醫科大學附屬盛京醫院普通外科，沈陽 110004）

作為死亡率極高的惡性腫瘤，胰腺癌在歐洲的致死率排名第四。我國胰腺癌致死率雖低于西方國家，但近年來發病率持續上升［1-2］。研究［3］表明，惡性腫瘤細胞的增殖與轉移均和激活轉錄因子2（activated transcription factor 2，ATF2）有關，例如在小鼠模型中發現，ATF2能夠通過激活細胞周期蛋白D1來參與雌二醇誘導的乳腺癌細胞增殖；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）作為代表性的凋亡抑制分子，其啟動子區域中的環磷酸腺苷反應元件可以與ATF2特異性結合來參與腫瘤細胞凋亡；在ATF2突變的小鼠中，調節凋亡基因GADD45α的表達也會降低［4］。提示ATF2與惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡過程相關。

目前關于胰腺癌細胞中ATF2的表達以及ATF2與胰腺癌細胞增殖和凋亡的關系仍缺乏研究。本研究擬通過檢測胰腺癌與癌旁組織中ATF2的表達情況，對比ATF2 shRNA轉染前后胰腺癌細胞株的增殖及凋亡情況，進一步探討ATF2與胰腺癌發生的關系以及對胰腺癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

胰腺癌及癌旁組織來源于中國醫科大學附屬第一醫院2014至2016年手術治療的胰腺癌患者，共14例配對標本，均經病理證實為胰腺導管細胞癌。癌旁組織取自距胰腺癌邊緣1～2 cm處。所有患者已簽署知情同意書，術前未接受放、化療及免疫治療。本研究獲得中國醫科大學醫學倫理委員會批準。胰腺癌細胞株ASPC-1購自中國科學院上海細胞庫，PANC-1購自上海中喬新舟生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分離、體外培養及ATF2 shRNA轉染：參考已有胰腺細胞的分離方法［5］，將胰腺組織碎塊（1 mm3）在適量V型膠原酶（美國Sigma公司）中孵育，而后在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基（美國Hyclone公司）中進行傳代培養，為后續RNA的提取做準備。

將ASPC-1及PANC-1細胞復蘇放置于37 ℃溫箱中（含5%的CO2）進行細胞傳代培養，并在24 h后進行ATF2 shRNA質粒和非特異性對照質粒（non-specific control，NC）的轉染。ATF2 shRNA片段：5’-GGA GCCUUCUGUUGUAGAAUU-3’。ATF2 NC片段：5’-T TCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

用含有10%胎牛血清的DMEM培養基篩選轉染穩定的胰腺癌細胞株，并將ASPC-1組細胞（ASPC-1、ASPC-1-NC、ASPC-1-ATF2 shRNA）及PANC-1組細胞（PANC-1、PANC-1-NC、PANC-1-ATF2 shRNA）進行收集，用于后續實驗。

1.2.2 細胞RNA提取、反轉錄及實時PCR檢測：收集細胞并使用RNA提取試劑盒提取總RNA。以super M-MLV反轉錄酶進行反轉錄后，采用ExicyclerTM96熒光定量儀（韓國BIONEER公司）對ATF2mRNA水平進行熒光定量分析。β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt分析法計算胰腺癌及癌旁組織中ATF2mRNA的表達。以同樣方法檢測ASPC-1及PANC-1組細胞中ATF2mRNA表達水平，驗證ATF2 shRNA的敲減效率。ATF2正向引物5’-TGGTAGCGGATTGGTTAG G-3’；ATF2反向引物5’-TTGGGTCTGTGGAGTTGT G-3’；β-actin正向引物5’-CTTAGTTGCGTTACACCC TTTCTTG-3’；β-actin反向引物5’-CTGTCACCTTCA CCGTTCCAGTTT-3’。

1.2.3 Western blotting檢測ATF2及p-ATF2蛋白表達：參考賀龍梅等［6］的研究，以ATF2、P-ATF2，β-actin抗體為一抗（英國Abcam公司），羊抗兔IgG-HRP為二抗（中國碧云天公司）進行免疫反應。在發光、顯影后觀察p-ATF2、ATF2及內參β-actin蛋白的表達。以同樣方法檢測ASPC-1及PANC-1組細胞中ATF2蛋白表達水平，驗證ATF2 shRNA敲減效率。

1.2.4 MTT實驗測定胰腺癌細胞生長曲線：采用MTT法檢測ASPC-1及PANC-1組細胞在4 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的細胞活力。

1.2.5 胰腺癌細胞平板克隆實驗：將ASPC-1及PANC-1組細胞培養至肉眼可見細胞克隆團，經多聚甲醛固定及瑞姬氏復合染料染色后，在顯微鏡下觀察各組細胞。

1.2.6 胰腺癌細胞周期檢測：培養ASPC-1及PANC-1組細胞，參照方法1.2.3，分別以Cyclin A和Cyclin D1抗體作為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP作為二抗，采用Western blotting檢測各組細胞中Cyclin A和Cyclin D1的表達水平。

1.2.7 胰腺癌細胞凋亡實驗檢測：培養ASPC-1及PANC-1組細胞，參照方法1.2.3，分別以cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax和Bcl-2抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP作為二抗，采用Western blotting檢測各組細胞中細胞凋亡相關蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

采用Gel-Pro-Analyzer軟件對Western blotting圖像進行處理，分析目標條帶光密度值。采用GraphPad軟件進行統計學分析，繪制統計圖，數據以表示，組間差異采用獨立樣本t檢驗。實時PCR數值分析采用2-ΔΔCt分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌及癌旁組織中ATF2 mRNA的表達水平

采用紫外線分光光度計NANO2000（美國Thermo公司）分別檢測胰腺癌及癌旁組織提取出的RNA。結果顯示RNA純度良好，可用于后續實驗。實時PCR結果顯示，胰腺癌組織中ATF2mRNA的表達（0.001 3±0.000 4）高于癌旁組織（0.000 9±0.000 2），見圖1。

圖1 ATF2 mRNA在胰腺癌組織和癌旁組織中表達情況Fig.1 Expression levels of ATF2 in pancreatic cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 胰腺癌及癌旁組織中ATF2和p-ATF2蛋白的表達水平

以β-actin為內參，采用Western blotting檢測胰腺癌及胰腺癌旁組織中ATF2和p-ATF2蛋白的表達水平（圖2A）。結果顯示，胰腺癌組織中ATF2蛋白表達水平（0.50±0.03）較癌旁組織（0.25±0.02）顯著上調（圖2B）；同時胰腺癌組織中p-ATF2的蛋白表達水平（0.71±0.04）與癌旁組織（0.40±0.03）相比也呈上調趨勢（圖2C）。

圖2 Western blotting檢測胰腺癌及癌旁組織中ATF2和p-ATF2蛋白表達Fig.2 Detection of ATF2 and p-ATF2 levels by Western blotting in the PC tissues and ANT

2.3 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞增殖的抑制作用

MTT檢測結果顯示，在轉染24 h、48 h、72 h、96 h后ASPC-1-ATF2-shRNA及PANC-1-ATF2-shRNA組細胞增殖與對應NC組相比均顯著抑制（P＜0.01）（圖3）。轉染120 h后的ASPC-1-ATF2-shRNA組細胞仍受到抑制（P＜0.05）（圖3A），而120 h后PANC-1-ATF2-shRNA組細胞的增殖抑制效果更為顯著（P＜0.001）（圖3B）。

圖3 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞增殖的抑制作用Fig.3 ATF2 silencing inhibited the proliferation and colony formation of PC cells

2.4 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞周期蛋白的抑制作用

以β-actin為內參，采用Western blotting檢測Cyclin A及Cyclin D1蛋白表達水平。結果顯示，ASPC-1-ATFshRNA處理組中Cyclin A（0.67±0.02）及Cyclin D1蛋白表達量（0.53±0.01）與ASPC-1-NC組（1.07±0.03和1.03±0.03）相比均顯著下降（P＜0.01）。同時PANC-1-ATF-shRNA處理組Cyclin A蛋白的表達量（0.63±0.02）與對應NC組（1.13±0.03）相比也顯著下降（P＜0.01），見圖4。

圖4 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞周期蛋白的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of ATF2 shRNA on cyclin in pancreatic cancer cells

2.5 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞凋亡的促進作用

采用流式細胞術檢測 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞凋亡的影響，結果顯示，ATF2 shRNA PANC-1和ATF2 shRNA ASPC-1中細胞凋亡與NC組相比明顯增多（P＜0.01，P＜0.001），見圖5。

圖5 流式細胞術顯示ATF2 shRNA促進胰腺癌細胞凋亡Fig.5 Flow cytometry showed that ATF2 shRNA promoted the apoptosis of pancreatic cancer cells

以β-actin為內參，采用Western blotting檢測細胞凋亡相關蛋白，與NC組相比，ATF2 shRNA PANC-1、ATF2 shRNA ASPC-1中cleaved caspase-3、cleaved PARP表達量均上調2倍左右；而Bcl-2的表達量在ATF2 shRNA PANC-1中約下調5倍，見圖6。

圖6 ATF2 shRNA對胰腺癌細胞凋亡的促進作用Fig.6 Promoting effect of ATF2 shRNA on the apoptosis of pancreatic cancer cells

3 討論

胰腺癌相關診斷和治療的準確性及有效性在近些年來有顯著提升，但其5年生存率仍較低［7］。雖然各種新型治療方案有效地提高了胰腺癌術后患者的長期預后，但只有15%～20%的患者適合行手術治療。因此，為了有效提高胰腺癌患者的生存時間和質量，縮短胰腺癌診斷時間，提高診斷的準確性刻不容緩［8-10］。

轉錄因子是調節細胞基因表達的主導因子，通過與基因組靶點的精準結合影響轉錄［11］。ATF2作為ATF/cAMP轉錄因子家族的成員之一，可促進與細胞周期、免疫、炎癥反應及細胞凋亡相關的靶基因表達［12］。ATF2已被證實可調節腫瘤上皮細胞的間質轉化，參與細胞糖代謝和腫瘤發生，并且能夠影響腫瘤細胞的侵襲性［13］。但目前關于ATF2與胰腺癌相關性的研究還鮮有報道。本研究通過實時PCR及Western blotting 檢測發現，胰腺癌組織中ATF2的mRNA和蛋白的表達水平均高于癌旁組織，表明ATF2可能為胰腺癌的潛在標志基因，在未來的診斷上具有一定的應用價值。

惡性腫瘤具有細胞分化和增殖異常、生長失去控制、細胞凋亡受抑制等特性，關注以上特性是否隨某基因表達量的改變而變化，可以進一步證明該基因對癌細胞產生的生物學行為［14］。本研究采用基因沉默技術，構建了ATF2 shRNA表達載體并成功轉染了胰腺癌細胞，通過流式細胞儀、Western blotting等檢測發現ATF的沉默會改變細胞增殖、周期和凋亡等特性。細胞增殖速率變慢的同時，細胞周期相關蛋白Cyclin A和Cyclin D1的表達也顯著降低，這與已有研究［15］關于ATF2可通過調控Cyclin A來影響細胞增值的結論相一致。cleaved PARP為Caspase家族凋亡基因啟動子，cleaved-caspase-3是程序性細胞死亡或凋亡的關鍵介質，2種蛋白表達增加時說明細胞凋亡增加［16］。Bcl-2和Bax作為Bcl-2家族成員，前者具有抑制凋亡的作用，而Bax具有促進凋亡的作用［17］。本研究結果顯示，與對照組相比，cleaved caspase-3、cleaved PARP與Bax的 蛋白表達水平上調，而Bcl-2的表達下調，這也進一步證實ATF2作為胰腺癌的致癌基因，對細胞凋亡及生長周期有重要影響。

綜上所述，ATF2可作為胰腺癌疾病診斷的潛在標志物，也可作為后續治療的靶標展開深入研究。同時，ATF2作為致癌基因的分子作用機制及其他臨床意義有待進一步研究。