激素抵抗性腎病相關基因變異在早年發病的難治性腎小球微小病變中的表達

楊旭，劉鳳東，欒軍軍，周華

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽 110004；2.東北大學醫院護理部，沈陽 110004）

腎小球微小病變（minimal change disease，MCD）是兒童中最常見的腎病綜合征的病理類型，在成人腎病綜合征中占10%～15%［1］。盡管絕大多數的MCD對激素反應敏感，但難治性腎病的病例也不少見。由于需要長期應用激素和（或）免疫抑制劑控制病情，患者可能出現嚴重的不良反應，如感染、股骨頭壞死等，并且少數患者治療無效，腎功能進行性惡化，最終可能需要進行腎臟替代治療，甚至死亡［2］。因此，明確難治性MCD的病因和發病機制、尋找有效的治療靶點、進行針對性治療、提高腎病綜合征的治愈率、減少復發率是有待解決的難題。

近年來，隨著越來越多的激素抵抗性腎病（steroid-resistance nephrotic syndrome，SRNS）相關基因變異的發現，人們越來越關注遺傳因素在難治性腎病中的作用［3］。兒童和青少年中，SRNS相關基因變異最常見于局灶性節段性腎小球硬化（focal segmental glomerulonephrosis，FSGS），而SRNS相關基因變異在難治性MCD患者中的研究很少。MCD多發于兒童，兒童時期是遺傳性疾病的好發年齡；同時，MCD與FSGS有一定聯系，有學者認為MCD與FSGS可能是同一種疾病的不同階段［4］?；谝陨蟽牲c推測，遺傳因素可能參與早年發病的難治性MCD的發病。因此，本研究選取30歲之前發病、病理類型表現為MCD的難治性腎病患者，采用高通量二代測序方法檢測患者是否存在SRNS相關基因變異，初步探索遺傳因素在難治性MCD發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2018年6月中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科收治發病年齡＜30歲、病理類型為MCD的難治性腎病患者7例。選取同期病理類型為FSGS的腎病患者2例（陽性對照）和年齡匹配的健康人3例。12例研究對象中，男11例，女1例。

入選患者均符合原發性腎病綜合征診斷標準，MCD患者均為激素依賴或反復復發型腎病，符合難治性腎病的定義。排除繼發性腎病綜合征患者，包括狼瘡性腎炎、乙型肝炎相關性腎病、紫癜性腎炎等；排除合并病毒性肝炎、原發性高血壓、糖尿病、遺傳性疾病、癲癇、血液系統疾病或惡性腫瘤患者。本研究獲得中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準（2017PS012K），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本收集與處理

留取研究對象外周EDTA抗凝靜脈血5 mL，同樣方法留取患者父母外周靜脈血5 mL。采用NaI法提取外周血白細胞基因組DNA，-20 ℃保存備用。

1.3 基因檢測

采用北京邁基諾公司提供的與遺傳性腎小球病相關的74種基因組成目標基因penal，其中包括62個SRNS相關基因。利用高通量二代測序方法檢測研究對象是否存在目標基因的變異，然后利用第一代Sanger基因測序技術對父母的基因進行驗證，從而確定患者基因變異的來源。

74種基因包括ACTN4、MYO1E、COQ9、SLC35A2、ARHGDIA、PAX2、GLA、ZMPSTE24、ALG1、NEIL1、CRB2、SMARCAL1、B2M、PDSS1、INF2、LAMC2、ANLN、NEK8、CUBN、THSD7A、CD151、PDSS2、ITGA3、LMX1B、APOA1、NPHP3、DGKE、TRPC6、CD2AP、PEX1、ITGB4、COL4A4、APOE、NPHS1、EMP2、TSC2、CFH、PLA2R1、KANK1、APOL1、NPHS2、FAT1、UMOD、COL4A3、PLCE1、KANK2、ARHGAP24、NUP107、FGA、WDR73、COL4A4、PMM2、KANK4、COQ6、NUP205、FLG、WT1、COL4A5、PTPRO、LAMA3、COQ8A、NUP93、FN1、XPO5、COQ2、SCARB2、LAMB2、COQ8B、SLC17A5、LAMB3、LYZ、MEFV、MYH9、MME。

2 結果

2.1 研究對象的基本特征

本研究共納入7例難治性MCD患者，2例初治的FSGS患者，3例健康人。同時收集到4例MCD患者父母的樣本。7例MCD患者中，幼年發?。òl病年齡＜14周歲）3例，中位年齡25歲，均為男性；成人發?。òl病年齡14～30周歲）4例，中位年齡26.5歲，均為男性。2例FSGS患者，中位年齡20歲，男1例，女1例。3例健康人，中位年齡26歲，均為男性。

2.2 基因檢測結果

7例難治性MCD患者中發現1例SRNS相關基因變異，為成人發病的MCD患者（6號）。分析該患者樣本，發現胞環蛋白肌動蛋白結合蛋白（ANLN）基因有1個雜合突變，遺傳方式是常染色體顯性遺傳，經家系驗證分析，變異來自患者母親。該患者同時發生了地中海熱（MEFV）基因純合突變，經家系驗證分析，其父母在該位點均為雜合突變，但這個基因不屬于已知的SRNS相關基因。FSGS患者（8號）中也發現1例SRNS相關基因變異，是瞬時受體電位通道6（TRPC6）基因的1個雜合突變，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。健康人中未發現有意義的SRNS相關基因變異。見表1。

表1 研究對象的一般資料和基因檢測結果

在幼年發病的MCD患者中發現LAMB2（100%，3/3）和PLCE1（67.7%，2/3）雜合突變的發病率明顯升高，而在成人發病的MCD患者和FSGS患者中未發現這2種基因突變。健康人中僅有1例LAMB2突變。這些基因突變的位點各不相同。

3 討論

本研究利用高通量二代測序方法，對30歲之前發病的難治性MCD患者SRNS相關基因位點的變異情況進行了初步研究，在1例成人發病的MCD患者中發現了ANLN雜合突變，該患者同時發現MEFV純合突變。在3例幼年發病的MCD患者中，發現了極高比例的LAMB2和PLCE1雜合突變，提示遺傳因素可能參與難治性MCD的發病。但由于本研究納入的病例數較少，需要納入更多病例的研究證明這一結論。

ANLN編碼的anillin是F-肌動蛋白結合蛋白，在腎臟的腎小管普遍表達，在腎小球表達很少，2014年首次在一個常染色體顯性遺傳的FSGS引起的腎病綜合征家系中，確定了ANLN變異是引起家族性FSGS腎病綜合征的病因。家族性FSGS腎病綜合征中足細胞中anillin的表達增加。功能研究［5］結果表明，anillin對于保持足細胞肌動蛋白細胞骨架的完整性發揮重要作用。進一步的研究［6］顯示，ANLNR431C變異可以通過激活PI3K/AKT/mTOR/p70S6K/Rac1通路引起足細胞功能的多重紊亂，而鈣調神經酶抑制劑可能部分通過抑制ANLN和mTOR發揮減少尿蛋白的作用。本研究在成人發病的MCD患者中也發現了該基因變異，患者為激素依賴性腎病，經過超長程的激素聯合霉酚酸酯治療，目前患者病情緩解。這例MCD患者中還發現了MEFV基因純合突變。MEFV基因突變主要與家族性地中海熱有關［7］，但該患者并無發熱、漿膜炎等自身炎癥綜合征的表現。有研究［8］證實了家族性地中海熱患者也可以合并其他類型的腎臟損害，如血管炎、紫癜性腎炎、急進性腎炎和原發性腎炎。土耳其學者發現，原發性腎小球腎炎合并MEFV變異的比率高達35.9%［9］。MEFV的編碼蛋白pyrin是固有免疫的一種重要的調節劑，它是組成炎癥小體的重要成分，可以導致細胞焦亡，其中研究最多的是細胞質核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體［10］。目前的研究［11］發現，NLRP3的激活與足細胞損傷密切相關，參與多種腎臟疾病的發病，針對NLRP3及其組成成分的小分子抑制劑是很有前途的治療劑。MEFV基因突變導致pyrin功能損害，從而導致炎癥反應失控，是引起家族性地中海熱的主要病因［12］。這種過度的炎癥反應很可能促進了免疫介導的足細胞損傷，產生蛋白尿。在另一例成人發病的MCD患者中發現了MEFV基因在同一位點的變異，對于這個變異位點編碼蛋白的功能研究有助于進一步明確MEFV基因變異在難治性MCD發病中的作用。

先天性腎病綜合征最常見的致病基因包括NPHS1、NPHS2、WT1、LAMB2和PLCE1［13］。本研究在3例幼年發病的MCD患者中發現了極高比例的LAMB2和PLCE1雜合突變，與成人發病的MCD患者的基因變異明顯不同。因此推斷，多種先天性腎病綜合征相關基因的微基因效應可能存在于幼年發病的難治性MCD患者中，未來研究需要納入更多的病例證明這一點。

本研究在1例男性FSGS患者中發現TRPC6雜合突變，這是目前發現的成人發病的常染色體顯性遺傳SRNS相關的基因突變之一。TRPC6是足細胞裂孔膜的重要成分，其變異被認為與nephrin減少有關［14］。目前共有31例伴有TRPC6變異的兒童或青少年發病的難治性腎病的病例報告，其中包括2例MCD患者［15］。本研究在1例成人發病MCD患者中發現SRNS相關基因變異，在其余3例成人發病MCD患者和1例女性FSGS患者中也發現了1種及以上常染色體隱性遺傳遺傳的SRNS相關基因的雜合突變，但理論上必須是純合基因突變才致?。桓匾氖?，在3例健康人中也發現多種常染色體隱性遺傳SRNS相關基因的雜合突變，因此不能推斷這些基因變異是與難治性腎病相關的致病性突變。

綜上所述，本研究初步探討了遺傳因素是否參與了早年發病的難治性MCD的發病，并在7例患者中發現SRNS相關基因變異。但本研究存在不足之處：納入的病例數少，未進行功能試驗。目前還有新的SRNS相關基因被不斷發現，因此通過進一步增加樣本量、擴大檢測范圍及運用全基因組檢測方法，可能會發現更多的基因變異，甚至是全新的基因。這有望揭示難治性MCD的發病機制，避免激素和免疫抑制劑的過度應用，同時可能為難治性MCD的治療提供新的靶標。