高產阿魏酸酯酶菌株的篩選鑒定及產酶條件優化

王清龍，陳園園，劉延波，5，劉洪亮，王永華，朱金曉，張曉靜，潘春梅*

（1.河南牧業經濟學院 理學部，河南 鄭州 450046；2.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院（酒業學院），河南 鄭州 450046；3.河南牧業經濟學院 河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業經濟學院鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；5.河南仰韶酒業有限公司 博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；6.河南蔡洪坊酒業有限公司，河南 駐馬店 463500）

阿魏酸，又名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸（C10H10O4），易溶于極性溶劑[1]，是由阿魏酸酯酶（ferulic acid esterases，FAEs）水解酯鍵產生的酚酸類物質[2]，普遍存在于禾本科植物（如麥麩、高粱皮、豌豆皮、作物秸稈等）中[3-4]，通常以酯鍵、縮醛鍵等與大分子物質構成交聯的致密成分，保持細胞的機械完整性[5-8]，具有疏散血小板、清除自由基、提高免疫力、預防阿爾茲海默癥等功效[9-10]，是藥品、食品等行業領域的重要原料[11-13]。水解阿魏酸的方法有多種，其中微生物酶解法具有低成本、安全環保、高效率等的優點，因此，篩選能夠產生阿魏酸酯酶的菌株，發酵釋放阿魏酸是最經濟適用的方式[14-15]。

“有美酒必備佳曲”、“曲為酒之骨”[16]，濃香型大曲是以高梁為主要原料，混合大麥、小麥，并配以一定比例的豌豆粉碎成顆粒狀[17-18]，加水拌料制成磚塊狀的曲坯，在可控的溫度和濕度環境下培養而成的中高溫大曲[19]。大曲富含有許多微生物和酶類[20]，在白酒生產過程中具有糖化和生香作用[21]；此外，白酒中風味化合物的形成也是源于酒曲中微生物的發酵作用[22]。目前，我國各種名優白酒大都使用傳統的大曲法固態發酵釀造[23]。近年來，增加白酒中健康成分的含量，提高白酒的營養價值，是中國白酒釀造產業的發展趨勢[24]，因此，眾多白酒研究人員致力于分離篩選更多功能性菌株。目前，有關產阿魏酸酯酶菌株的篩選主要是從土壤或者腐質樣品中篩選，而在白酒相關中的研究較少且酶活力較低[25-26]。

該研究采用透明圈法從濃香型白酒大曲中篩選高產阿魏酸酯酶的菌株，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并以阿魏酸酯酶活力為評價指標，通過單因素試驗及響應面試驗對其發酵條件進行優化，以期提高白酒中阿魏酸的含量，提高白酒品質，為白酒增添更多功能性的健康因子。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒大曲：河南蔡洪坊酒業有限公司；麩皮：鄭州某超市。

1.1.2 試劑

硫酸銨、硫酸鎂、FeCl3、檸檬酸、檸檬酸鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（色譜純）、瓊脂粉（生化試劑）：上海麥克林生化科技有限公司；阿魏酸、阿魏酸乙酯（均為分析純）：賽國生物科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.1.3 培養基

初篩培養基[25]：NaCl0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，（NH4）2SO41.3 g/L，瓊脂粉18 g/L，10%阿魏酸乙酯溶液（溶于N,N-二甲基甲酰胺）15 mL/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB固體培養基[25]：NaCl 0.1 g/L，蛋白胨0.1 g/L，酵母粉0.05g/L，瓊脂粉0.18g/L，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

產酶液體培養基[25]：酵母粉1 g/L，KH2PO40.37 g/L，（NH4）2SO41.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，CaCl2·2H2O 0.07 g/L，FeCl30.02 g/L，10%阿魏酸乙酯溶液（溶于N,N-二甲基甲酰胺）5 mL/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DNP-9272BS型恒溫培養箱、DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；DGL-50B立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海力辰儀器有限公司；3-18KS型高速冷凍離心機：德國Sigma公司；FUB紫外可見分光光度計：上海科曉科學儀器有限公司；GelDoc-IT2 315凝膠成像系統：美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 產阿魏酸酯酶菌株的分離及篩選

將釀酒大曲粉碎，稱取20 g加入含180 mL無菌水的三角瓶，于28 ℃、200 r/min的恒溫搖床培養40 min，室溫靜置3 min，取上清液按10倍梯度系列稀釋至10-7，取50 μL稀釋的菌懸液涂布于初篩培養基上，28 ℃靜置培養24 h。

初篩：挑取具有透明圈的菌株劃線于LB固體培養基上進行多次分離、純化，得到單菌落[27]。

復篩：將初篩得到的菌株接種于產酶液體培養基中，28 ℃、180 r/min條件下72 h，測定發酵液中阿魏酸酯酶酶活力，篩選酶活力最大的菌株為目標菌種，保藏備用[28]。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活力的測定

取發酵液1 mL，12 000 r/min離心15 min，棄沉淀取上清[29-30]。以去淀粉麥麩[31]為底物測定酶活，以煮沸失活的酶液為空白，每組3個平行實驗，具體方法參照文獻[32-33]。以阿魏酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制得到阿魏酸的標準曲線，得到回歸方程：y=0.089 4x-0.088 8，相關系數R2=0.996 0，說明阿魏酸質量濃度與吸光度值在此范圍內線性關系良好。

酶活力定義：在反應條件55 ℃、pH值6.0時，每分鐘水解底物釋放1 μmol阿魏酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.3 菌種鑒定

形態學鑒定：觀察菌落的形狀、表面特征，挑取單菌落染色制片，光學顯微鏡下觀察細胞形態。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏系統細菌學手冊》[34]進行生理生化試驗。

分子生物學鑒定[35]：委托生工生物工程（上海）有限公司對菌株的16S rDNA基因序列進行擴增并測序，將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA11軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 菌株產阿魏酸酯酶發酵條件優化

單因素試驗：以菌株接種量4%（V/V）、發酵溫度28 ℃、轉速180 r/min、培養基初始pH自然、發酵時間72 h作為初始發酵條件[36]，分別探究發酵溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）、發酵時間（36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）、接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對菌株產阿魏酸酯酶活力的影響。

響應面試驗：在單因素試驗結果的基礎上，選出對目標菌株產阿魏酸酯酶酶活力影響最大的3個因素接種量（A）、發酵溫度（B）和初始pH值（C）作為自變量（X），酶活力為響應值（Y），采用Design-Expert 8.0.6設計Box-Behnken試驗[37]。

1.3.5 數據處理

使用IBM SPSS V22.0軟件進行單因素方差分析，采用Design-Expert 8.0.6分析響應面回歸模型，試驗重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 產阿魏酸酯酶菌株的篩選結果

2.1.1 初篩結果

將大曲樣品稀釋后涂布于初篩培養基上，經分離和篩選后，共獲得9株產透明圈的菌株，命名為M1～M9。

2.1.2 復篩結果

測定初篩得到的9株菌的阿魏酸酯酶酶活力，結果見表1。由表1可知，菌株M2的阿魏酸酯酶活力最高，為（30.8±0.05）U/L，因此，以菌株M2為目標菌株。

表1 初篩菌株阿魏酸酯酶活力測定結果Table 1 Determination results of ferulic acid esterase activity of the first screening strains

2.2 菌株M2的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

菌株M2的菌落及細胞形態見圖1。由圖1a可知，菌株M2的單菌落為乳白色，形狀為規則的圓形，表面光滑，菌落中心凸起，邊緣整齊。由圖1b可知，細胞呈長桿狀，細菌特征明顯，革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌（G+）。

圖1 菌株M2的菌落（a）及細胞（b）形態特征Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain M2

2.2.2 生理生化鑒定

菌株M2的生理生化試驗結果見表2。由表2可知，菌株M2可水解利用淀粉、乳糖、麥芽糖，VP試驗、MR試驗及明膠試驗結果均為陽性，H2S試驗結果為陰性。根據《常見細菌系統鑒定手冊》，初步鑒定菌株M2為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 菌株M2的生理生化試驗結果Table 2 Results of physiological and biochemical experiments of strain M2

2.2.3 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構建菌株M2的系統發育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株M2與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在進化關系上具有最近的親緣關系，結合菌株M2的菌落形態特征及生理生化鑒定結果，最終鑒定菌株M2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株M2的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain M2 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株M2產阿魏酸酯酶發酵條件優化單因素試驗結果

2.3.1 發酵溫度對菌株M2產阿魏酸酯酶活力的影響

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，阿魏酸酯酶活力呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是隨著溫度的升高，菌株的部分理化條件遭到破壞，導致其產酶能力下降[38-39]。當發酵溫度為30 ℃時，酶活力最高，為32.95 U/L，由此確定該菌株產阿魏酸酯酶的最佳發酵溫度為30 ℃。

圖3 發酵溫度對菌株M2產阿魏酸酯酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.3.2 發酵培養時間對菌株產酶活力的影響

由圖4可知，當發酵時間在36～72 h范圍時，隨著發酵時間的延長，酶活力呈升高趨勢，可能是由于發酵初期氧氣充足，菌體繁殖快；當發酵時間為72 h時，酶活力最高，為30.80 U/L；當發酵時間＞72 h之后，酶活力呈下降趨勢，可能是由于培養時間超過了菌株的對數生長期，菌株開始衰亡，且產生的代謝副產物對產酶造成不利影響[40]。由此確定該菌株產酶的最佳培養時間為72 h。

圖4 發酵時間對菌株M2產阿魏酸酯酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.3.3 接種量對菌株產酶活力的影響

由圖5可知，在接種量為2%～5%的范圍內，隨著接種量的增大，酶活力呈升高趨勢，可能是由于發酵初期營養充足，菌體生長狀況良好[41]；當接種量為5%時，酶活力達到最大值，為32.60 U/L；當接種量＞5%之后，酶活力降低，可能是由于菌種之間競爭激烈，導致產酶能力減弱[41-42]。由此確定該菌株產酶的最適接種量為5%。

圖5 接種量對菌株M2產阿魏酸酯酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.3.4 初始pH對菌株產酶活力的影響

由圖6可知，當初始pH值＜5.5之前，阿魏酸酯酶活力呈升高的趨勢；當初始pH值為5.5時，酶活力達到最大值，為32.83 U/L；當初始pH值＞5.5時，酶活力呈緩慢遞減趨勢，說明培養基初始pH值的升高或降低都會減弱菌株的產酶能力。由此確定該菌株產酶的最佳初始pH值為5.5。

圖6 初始pH對菌株M2產阿魏酸酯酶活力的影響Fig.6 Effect of initial pH on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.4 菌株M2產阿魏酸酯酶條件優化響應面試驗結果

2.4.1 響應面試驗結果與分析

使用IBM SPSS V22.0軟件分析單因素試驗結果，選定影響顯著的因素接種量（A）、發酵溫度（B）和初始pH值（C），以阿魏酸酯酶活力（Y）為響應值，依據Box-Behnken試驗設計原理，設計3因素3水平的響應面試驗，試驗設計及結果見表3，回歸模型的方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

根據Design-Expert 8.0.6軟件中對表3數據進行多元回歸擬合分析，得到菌株M2產阿魏酸酯酶酶活力（Y）對發酵溫度（A）、接種量（B）及初始pH值（C）的多元二次回歸模型：

由表4可知，模型P值＜0.000 1，極顯著（P＜0.01），失擬項P=0.249 1，不顯著（P＞0.05），模型的決定系數R2=0.999 8，調整決定系數R2Adj=0.999 6，說明該回歸模型具有良好的擬合性。綜合分析，該回歸方程適用于對菌株M2產阿魏酸酯酶發酵條件的優化分析及預測。由P值可知，所有項對結果影響極顯著（P＜0.01）。

2.4.2 各因素間交互作用的響應面及等高線

探究各因素間交互作用的影響，對優化試驗數據進行二次響應面立體分析，并創建相應的響應面及等高線，結果見圖7。由圖7可知，各因素間交互作用對菌株M2產阿魏酸酯酶活力影響的響應面均呈凸形，存在最高點；等高線均呈橢圓形，說明交互作用極顯著，這與方差分析結果一致。

圖7 發酵溫度、初始pH值、接種量間交互作用對菌株M2產阿魏酸酯酶活力影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation temperature,initial pH and inoculum on the activity of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.4.3 最佳產酶條件的確定及驗證

采用Design-Expert 8.0.6對回歸擬合方程進行求解，得到最優發酵條件為發酵溫度29.91 ℃，接種量4.97%，初始pH值5.53。在該發酵條件下，阿魏酸酯酶活力理論值為33.90 U/L。為便于實際操作，將最佳發酵條件修訂為發酵溫度30 ℃，接種量5%，初始pH值5.5，發酵時間72 h，采用最優條件重復3次試驗，得到阿魏酸酯酶活力的實際值為（33.89±0.02）U/L，與預測值接近。結果表明，該模型的預測值與實際值具有良好擬合度，可用于對菌株M2產阿魏酸酯酶發酵條件的優化及預測。

3 結論

本研究從白酒釀酒大曲中篩選到一株產阿魏酸酯酶的菌株，編號為M2，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。通過單因素試驗及響應面試驗確定該菌株產酶的最佳條件為接種量5%，發酵溫度30 ℃，初始pH值5.5，發酵時間72 h，在此優化條件下，酶活力為33.89 U/L，比優化之前提高了10.03%，阿魏酸是白酒中的健康成分，阿魏酸酯酶對白酒釀造過程中阿魏酸的釋放有積極作用，本研究為提高白酒中阿魏酸的含量提供了理論基礎，下一步可將該菌株用于白酒釀造，預期可提高白酒的健康成分。