桑椹酒質量安全控制技術研究進展

張 龍，鄧娜娜，周存山

（1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.南京神農園食品產業有限公司，江蘇 南京 211219；3.鎮江彩桑梓食品有限公司，江蘇 鎮江 212013）

桑椹（mulberry）俗稱桑棗、桑果、桑子等，是桑樹的果實。桑椹具有很高的營養健康價值，1993年被列入《按照傳統既是食品又是中藥材的物質目錄》。據《本草綱目》、《中華人民共和國藥典》、《中藥大辭典》等描述，其味甘性寒，歸心、肝、腎經，生津潤燥、護肝益腎、烏發明目[1]。桑椹的健康價值高，多酚、花色苷、多糖、纖維素、微量元素硒等含量豐富[2-3]，因此表現出較高的抗氧化活性以及良好的降血糖效果[3-4]。每年桑椹5～6月成熟，采收期約2～3周，且采收期間環境溫度達30 ℃左右。桑椹成熟后采收難度高，采收和儲運過程中極易造成損傷，酵母菌、霉菌、醋酸菌等微生物利用糖度高、酸性低的桑椹汁快速生長繁殖[5]。桑椹果采收、儲運等難度大，鮮果質量安全控制存在不確定性，原料的特殊性限制了其產業化加工，導致深加工產品較少。常見的粗加工產品桑椹凍果以及深加工產品如桑果汁、桑果干、桑果醬、桑椹酒等，總體產業技術水平有待提升。短時間內將桑椹原料大批量迅速加工的方式只有速凍加工、果汁加工和果酒釀造，而桑椹酒是利潤高、保質期長的深加工產品。

工業化釀造桑椹酒歷史較短，沒有成熟的技術工藝標準，因此多借助既有的葡萄酒生產設備加工。桑椹酒釀造工藝研究以及產業化的關鍵問題集中于控制甲醇、雜醇油、揮發酸含量，突出桑椹酒的色澤、風味，以及提高桑椹酒的儲藏穩定性等方面[6-8]。桑椹酒的釀造也面臨新的挑戰，如長江以南地區菌核病易發，為防治病害過量噴施農藥等問題突出，農藥殘留也成為新的潛在安全問題[9-10]。桑椹酒釀造技術研究最重要是服務于產業需求，但很多研究基于科學問題，其提供的實驗參數是在嚴格的試驗條件下得出，無法很好地指導不確定性較強的生產實踐活動。因此該文對現階段桑椹酒釀造關鍵技術研究進行總結分析，同時結合多年桑椹酒產業化經驗對桑椹酒產業化釀造對策開展討論，為相關研究與應用提供參考。

1 桑椹酒揮發酸控制

果酒中揮發酸是低沸點酸的總稱，主要是乙酸，揮發酸含量較高時影響桑椹酒的感官品質[11]。實踐生產中桑椹酒揮發酸含量的限值通常參考紅葡萄酒，桑果酒行業內大多數工廠規定≤1.2 g/L，有些工廠設定最高限量值是1.5 g/L。微生物生長繁殖是產生揮發酸的主要原因，通常是不可避免的但人們希望將其含量控制在較低水平。揮發酸積累不僅與桑椹酒釀造每個過程（從原料到原酒）有關，還與原酒儲存條件相關。

1.1 發酵原料對揮發酸的影響

原料新鮮程度和處理及時性影響桑椹酒揮發酸含量[11]。桑椹是一種聚合小漿果，沒有類似于葡萄、藍莓一樣的外皮保護，極易受到微生物侵染，在成熟之前已經附著了大量的霉菌、野生酵母菌、醋酸菌等雜菌。30 ℃左右的環境溫度下，采收、運輸過程造成的損傷為微生物生長繁殖提供了適宜的條件，盡可能減少原料微生物繁殖非常重要。

以鎮江地區桑椹酒釀造為例，通常初期采收的桑椹原料質量較好，后期采收的桑椹容易附著較多的雜菌。桑椹成熟后有一部分自然脫落，在田間發酵、腐爛通常有明顯的“酒香味”和“酸味”，即由酒精發酵和醋酸發酵引起。地面雜菌快速生長繁殖，通過塵土、采收工具等侵染到樹上以及已經采收的桑椹。長期觀察發現干燥的天氣對桑椹采收質量有顯著的影響，潮濕悶熱的天氣誘導微生物在桑椹上生長繁殖，甚至肉眼可見霉菌菌絲。采收初期的桑椹用于桑椹酒釀造，揮發酸含量相對較低，干燥涼爽的天氣有積極的影響。地面覆膜、及時清洗采收工具均是有效降低揮發酸含量的方法。采收后的鮮果及時壓榨發酵非常關鍵，通常控制在4 h內，且對原料采取一定的控溫措施不可堆疊和暴曬，防止溫度過高。

采收后的桑椹應及時加工，有條件的情況下降低原料田間熱、采用冷藏運輸方式能夠有效地保證桑椹的新鮮度。采摘后的桑椹放置時間超過6 h很容易產生發酵風味，中心溫度升高甚至有結塊的現象。將桑椹凍結后保存于-18 ℃冷庫，待采收季節結束后統一解凍加工，由于凍結和解凍時間較長且不均勻，易造成醋酸菌等雜菌生長繁殖，很難將桑椹酒揮發酸含量控制在1.0 g/L以內。

將加工前處理前移至田間地頭有利于降低桑椹酒揮發酸含量。在田間搭建簡易且衛生的場地，采收后的桑椹立即除渣取汁，按150 g/t加入焦亞硫酸鉀，按200～250 g/t加入活化的安琪酵母（其中CECA與BV818質量比為1∶1），按750 g/t加入酒石酸。處理后的果汁（漿）2 h內運抵工廠調入果膠酶等輔料后（21±3）℃下發酵。按此方法發酵的桑椹酒主發酵結束后揮發酸含量為0.35 g/L，成品桑椹酒揮發酸含量為0.6 g/L。此方法處理的優點在于：避免了醋酸菌、霉菌等雜菌在運輸過程中大量繁殖。采用焦亞硫酸鉀和酒石酸及時控制雜菌的生長繁殖，且盡可能迅速地使酵母菌成為優勢菌，桑椹酒的色澤品質也較好。

1.2 釀造工藝對揮發酸生成量的影響

1.2.1 衛生管理和原料前處理

發酵所用的器具和管道均需要清洗、消毒，將可能存在的醋酸菌殺滅。使用焦亞硫酸鉀水溶液配制總SO2質量濃度為0.3 g/L的消毒液浸泡清洗器具，操作中添加1.0～2.0 g/L檸檬酸降低pH有利于提高游離SO2含量從而提升殺菌效果。在采摘的桑椹原料上噴灑二氧化硫水溶液可起到一定程度的保鮮作用，但需要記錄SO2使用量避免最終桑椹酒SO2含量超標。

1.2.2 酵母的選擇與接種量的控制

揮發酸含量與釀酒酵母相關，選擇發酵能力強、增殖迅速的酵母，適當增加酵母接種量均能夠幫助酵母菌在盡可能短的時間內成為優勢菌[12]，通過競爭性抑制控制醋酸菌等生長繁殖。

采用克魯維酵母CVE-7發酵葡萄酒，研究發現發酵過程中可顯著提升乳酸含量而降低發酵液的pH值，當克魯維酵母與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同時混合發酵時揮發酸含量為0.27 g/L，香氣、色澤、干浸出物等指標均得到提升[13]。酸對果酒風格的形成具有重要的作用，非傳統釀酒酵母的增酸技術可有效提升酒的品質[14]。腰果酒釀造時采用釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵，改善了腰果酒的風味品質，揮發酸含量最低0.2 g/L[15]。貝酵母抗逆性強、增殖迅速，是桑椹酒釀造較為合適的菌種。為了達到風味與發酵能力平衡，可以選擇2種酵母混合使用，搭配比例則需要通過具體的試驗選擇。選擇低產揮發酸的酵母釀造桑椹酒是值得嘗試的新思路，常壓室溫等離子體誘變釀酒酵母NX4得到具有良好的遺傳穩定性的低產揮發酸突變菌株T2-5，對糖耐受性更高且具有更低的酒精耐受性，在冰酒釀造試驗中揮發酸含量降低了26.4%[16]。

桑椹酒發酵酵母接種量約0.20 g/L，為了讓酵母菌迅速成為優勢菌可適當將接種量提高到0.25 g/L。邢慶洋[17]篩選出適合桑椹酒釀造的Y1酵母菌，種子液接種量為8%，該酵母遲滯期較短，啟動發酵迅速，桑椹酒的香氣等感官指標較好。促進酵母生長代謝的措施能夠降低揮發酸含量，如添加果膠酶、纖維素酶、糖化酶、Zn2+、Mg2+、K+，而添加復合酶時揮發酸含量降低至0.66 g/L[18-19]。

1.2.3 發酵溫度及SO2濃度

桑椹酒發酵溫度控制與葡萄酒不同，不能夠有大的偏差，建議嚴格控制在18～25 ℃避開醋酸菌等細菌生長最適溫度。在此發酵溫度下，通過試驗比較酵母的發酵特性選擇合適的酵母。張晶等[20]對桑椹酒發酵糖度、溫度、pH、接種量等參數進行優化，當溫度為28 ℃時揮發酸含量為1.32 g/L，雖感官評分良好但揮發酸含量偏高。吳桂君[21]的研究表明，保持低溫（5 ℃）、較低pH（3.7～3.8）和較高SO2殘留量（60mg/L）可以有效控制枸杞酒中揮發酸的穩定性。張志蘭等[22]采用1 g/L膨潤土澄清處理后的桑椹汁16～19 ℃發酵，能夠顯著降低桑椹酒中揮發酸的含量，最低0.12 g/L。

桑椹酒中SO2的限量一般參考葡萄酒標準GB 15037—2006《葡萄酒》[23]，總SO2質量濃度≤150 mg/L。實踐經驗表明，使用SO2時在不影響風味的情況下可以按略低于最高限值濃度使用，在原料打漿時一次性加入，后續各工藝環節中SO2部分損失，終產品SO2含量符合限值要求。在桑椹酒批量發酵中，采用壓榨汁18～24 ℃發酵5～6 d后壓榨，壓榨酒液18 ℃發酵2 d后采用0.8 g/L皂土下膠澄清，并將溫度降低至5 ℃，下膠澄清1周后過濾，保持15 ℃以下存儲3個月后測定揮發酸含量為0.6 g/L。

1.3 桑椹酒存儲管理

發酵結束后及時進行壓榨，在壓榨過程中混入空氣，促進酒液在短時間內繼續發酵消耗殘糖。此時發酵較為緩和，罐頂預留一定的空間，發酵結束后可進行倒罐、丟棄罐底沉淀、滿罐控溫存儲、陳釀。滿罐存儲排除了罐內空氣，抑制醋酸菌繁殖，充入適當二氧化碳或氮氣進一步排出空氣對抑制揮發酸的升高更為有利。建立巡檢制度尤為重要，檢測原酒的溫度、揮發酸含量等并進行感官評定。嚴格控制車間衛生管理，取樣后的閥門均需要消毒（使用體積分數75%乙醇）以避免雜菌污染。

2 甲醇含量的控制

桑椹酒釀造過程中產生副產物甲醇，參考紅葡萄酒標準，甲醇限量為400 mg/L。甲醇對人體有毒副作用，主要體現于麻醉中樞神經系統，甲醇及其代謝產物甲醛和甲酸對眼組織傷害較大，攝入甲醇5.0 g即可造成中毒，超過12.5 g可導致死亡[24-25]。控制桑椹酒中甲醇的含量提高桑椹酒飲用安全性具有重要的意義。桑椹酒中甲醇的產生與原料中果膠代謝、酵母菌生長代謝、甘氨酸代謝等有關[21]。

2.1 果膠代謝的影響

桑椹中果膠含量豐富，冷凍干燥后超聲波輔助提取得到多糖即果膠，含量為51.29～124.45 mg/g[26]。桑椹壓榨后的桑椹呈粘稠漿狀，發酵一定時間或者加入果膠酶酶解后粘稠度顯著下降即是果膠降解的原因。果膠主要存在于細胞壁和細胞內層，細胞破壁有利于胞內物質溶出。桑椹酒發酵過程中添加果膠酶酶解有助于提高出汁率，增強桑椹酒的風味和花色苷溶出，有利于主發酵后的壓榨操作以及桑椹酒的澄清，酶解是有必要的。

工業上使用的果膠酶多由微生物發酵制得，是一類酶的混合物，包括果膠酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶3種類型。果膠在果膠酯酶的作用下生成聚半乳糖醛酸鏈和甲醇[24，27]。張惠玲[28]在紅棗上選育果膠甲酯酶含量低的果膠酶產生菌，細胞融合技術獲得產果膠甲酯酶低，產多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶高的優良的果膠酶產生菌Rh-12，處理棗汁發酵低甲醇含量棗酒。沈志毅等[29]研究表明，果膠含量與甲醇生成量呈正相關性，添加果膠酶使甲醇含量增加。桑椹發酵過程有必要添加果膠酶，但不同的商業化果膠酶酶解產生甲醇的含量有顯著差異，這可能與酶活性以及酶的構成有關[30]。添加果膠酶的量不宜太高，以發酵結束后能夠順利壓濾且甲醇含量在限量以內為準。

產業化實踐中發現桑椹酒中甲醇的含量與采收的原料相關。采收前期的桑椹果膠含量較低，而隨著時間推移氣溫升高，采收后期的桑椹變得軟爛，壓榨汁中果肉較多且粘稠度增加，需要提高果膠酶使用量。由于果膠含量高、果膠酶施用量高導致甲醇生成量增高。因此，利用采收前期桑椹的壓榨汁發酵更適合桑椹酒的釀造。

2.2 酵母菌和甘氨酸代謝的影響

酵母代謝產生乙醇，在這個過程中甘氨酸在脫氨脫羧酶的作用直接生成甲醇，或者在甘氨酸裂解酶的作用下先生成甲胺，甲胺與亞硝酸反應產生甲醇[24]。桑椹中甘氨酸含量難以控制，但可以通過選擇代謝產甲醇含量低的酵母發酵桑椹酒。現代分子生物學已經成功用于工程菌的改造，通過基因工程改變微生物某一步或者某些代謝路徑，從而達到減少或者增加目標物質的積累[30]。熊志欽等[31]成功地敲除了參與甲醇生成的酵母基因GCV2，構建出工程酵母L5，使釀造酒中甲醇含量降低了31%。因此低產甲醇的發酵工程菌的研究具有重要的意義。

2.3 皮渣以及工藝參數的影響

桑椹酒釀造常采用兩種發酵工藝，一是全果破碎后帶渣發酵，二是壓榨過濾后果汁發酵。帶渣發酵干浸出物含量高，風味復雜香氣濃郁，但因為果膠含量較高，甲醇生成量也較高；而果汁發酵的桑椹酒產生甲醇含量較低。紅葡萄酒帶皮發酵與白葡萄酒清汁發酵工藝有較大的區別，因此紅葡萄酒甲醇限量400 mg/L，而白葡萄酒甲醇限量250 mg/L[23]。帶渣發酵的桑椹酒主發酵完成后及時進行渣汁分離有利于控制甲醇含量上升。采用桑椹汁18～21 ℃控溫發酵，由于果膠含量低，最終產甲醇含量可控制在100 mg/L以內。

除了2.2中所述酵母種類對甲醇產生顯著影響以外，酵母添加量、pH、發酵溫度對甲醇含量也有影響[12，30]。發酵溫度高甲醇含量高，可能是發酵溫度高果膠酶解更為徹底，也可能是溫度高影響酵母的甘氨酸代謝[12]。采用桑椹壓榨濁汁在20～25 ℃下發酵，當殘糖含量降至6 g/L時主發酵結束及時進行壓榨，然后20～25 ℃發酵2～3 d，按此工藝加工的桑椹酒甲醇含量為150 mg/L，滿足質量要求。當pH較低時果實的細胞壁發生溶解有利于果膠的溶出，pH 2.0時果膠桃果膠提取得率最高約2.1%[27]。王小東[30]研究表明，pH值與甲醇含量呈顯著負相關，pH越高甲醇含量越低。桑椹酒的酸度與原料品種和成熟度相關，一般桑椹的酸度較低，pH 4.6左右，增酸發酵后pH約為4.0，在此條件下甲醇生成量可控。在存儲過程中甲醇含量較為穩定，因此控制桑椹酒甲醇含量的措施應施加在釀造過程中[32]。

3 雜醇油含量的控制

雜醇油是一類兩個碳原子以上的低級醇的總稱，主要有丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇等[32-33]。雜醇油及其與乙酸等反應生成具有芳香味道的酯，對桑椹酒風味具有一定的貢獻，含量過高不僅對風味產生不利的影響，也不利于健康[34]。雜醇油分子質量大，在體內代謝慢，過量攝入可以刺激神經，使人感到頭痛、頭暈等不適癥狀即常說的“上頭”現象，控制桑椹酒雜醇油的含量在較低的水平尤為重要[35]。雜醇油的產生一般由氨基酸代謝引起，與氮源是否充足、氮源類型和釀造酵母及其生長條件相關[12，24]。

3.1 通過無機氮代謝控制雜醇油生成

氨基酸在脫羧酶和脫氫酶等的作用下產生，通常有2種產生途徑：一是氨基酸降解代謝路徑即Ehrlich代謝機制，即氨基酸在轉氨酶的作用下形成中間體α-酮酸；二是酵母以糖合成氨基酸的代謝路徑即Harris代謝機制，形成中間體α-酮酸，然后在脫羧酶作用下生成雜醇油[24，36]。無機氮和有機氮均可被微生物利用，研究表明，有機氮源的代謝產生雜醇油含量較高，而添加銨態氮則能夠降低雜醇油的含量，當發酵溫度為14 ℃，酵母接種量為0.40 g/L，發酵液中（NH4）2HPO4添加量為0.5 g/L時黑莓白蘭地原料酒中雜醇油含量最低為130.54 mg/L[12]。NH4HCO3添加量從0.05～0.15 g/L時，高級醇生成量逐漸降低[35]。添加無機氮源（NH4）2SO4后，酵母生長繁殖所需的氮源充足，減少了氨基酸等有機氮的代謝，因而降低雜醇油的生成量[36-37]。發酵時添加無機氮源如（NH4）2HPO4、（NH4）2SO4、（NH4）2CO3、NH4HCO3等有利于降低果酒、水果蒸餾酒中雜醇油的含量。

3.2 發酵工藝對雜醇油的影響

發酵用酵母菌影響雜醇油生成，通過篩選低產雜醇油的酵母可降低桑椹酒中雜醇油含量[36]。發酵溫度影響雜醇油的含量，溫度較高時酵母菌生長代謝速度較快，此時氨基酸代謝旺盛，高級醇轉化所需的酶活性較高，因此產生大量雜醇油，20 ℃以下雜醇油生成量較低，高于25 ℃時顯著升高[12，35]。添加果膠酶有助于破壁溶出糖類，為酵母生長代謝提供有利條件，因此有利于控制雜醇油含量[36]。

4 農藥殘留控制

4.1 科學用藥防治病害

溫度、濕度高的地區桑椹極易被植物病原菌菌核病侵害[9]，在新疆、東北、內蒙等地由于氣候干燥、氣溫相對較低，基本沒有白果病病害發生，無需噴施農藥進行防治。我國的桑樹病害近200種，其中以真菌病害為主，桑椹菌核病是危害桑椹最為嚴重的一種真菌病害，主要包括3類：桑椹肥大性菌核病、桑椹縮小性菌核病和桑椹小粒性菌核病[38-39]。桑椹被菌核病侵染后在成熟前萎縮變白，俗稱“白果病”，一旦果園爆發白果病甚至可造成桑椹顆粒無收，病原菌的生長繁殖也增加果園日后感染白果病的風險。桑樹萌芽、開花、掛果的幾個階段噴灑多菌靈等農藥可以有效控制白果病發生，受白果病害的基地需要在次年加大用藥量才能防止白果病再次發生。農藥過量使用和不科學的使用易造成桑椹農藥殘留處于較高水平，最終帶入桑椹酒中，是潛在的健康危害[9-10]。按照農藥消減的規律科學用藥減少農藥殘留，提高病害防治技術減少農藥噴施量。多菌靈、甲基硫菌靈、腐霉利、菌核凈、咪鮮胺等均能夠對肥大性菌核病起到較好的防治效果，混合使用農藥且避免連續兩年重復使用同一種化學藥劑是降低農藥殘留的方法之一[10]。

4.2 優選抗病品種和生物防治

在菌核病高發的地區，有些果桑品種抗病能力較強，對培育抗病品種具有重要的意義。鄭章云等[9]對21個果桑品種進行菌核病抗性研究，初步鑒定篩選出抗病能力強的臺灣長果桑品種1個，可作為抗病果桑品種的育種材料。采用生物拮抗作用防治桑椹菌核病也是人們研究的熱點。芽孢桿菌能產生酶類、活性蛋白類、多肽類、酚類等多種類型的抑真菌物質，此外他們自身的生長繁殖對真菌造成營養和空間上競爭性抑制[40]。

4.3 提高種植技術和田間管理水平

據長期從事果桑育苗、種植的中國農業科學院蠶業研究所季春忠介紹，加大行距和株距，每畝種植不高于50棵果桑，使田間通風、透氣、透光，在地面覆膜均是有效控制白果病的種植管理方法。保持通風透光且桑椹采收后進行剪伐，抑制了菌核病原菌生長繁殖，地面覆膜減少了菌核病菌寄生土壤的暴露，這些措施均能減少病害發生的概率。

5 結論

控制桑椹酒中揮發酸、甲醇、雜醇油含量以及降低農藥殘留十分關鍵。在此基礎上防止桑椹酒過度氧化，保持桑椹酒香氣（果香、發酵香）、色澤、澄清度、酒體結構等品質指標才更有意義。釀造原料的新鮮度（采收前期的桑椹、降低田間熱）以及加工及時性（4 h內加工）、發酵控制（溫度18～24 ℃、適當增加酵母接種量、選擇增殖快發酵能力強的酵母菌種）與原酒存儲管理（控溫不高于30 ℃、定期質量巡檢、衛生管理）均影響揮發酸的含量。而通過原料采收管理、去渣發酵、酵母菌篩選、添加無機氮源發酵、發酵溫度控制、主發酵結束及時分離壓榨等措施控制甲醇和雜醇油的含量。通過基因工程改造酵母菌使之低產甲醇和雜醇油將是有意義而又實用的研究。桑椹菌核病害防治帶來了高農藥殘留的潛在風險，合理使用農藥是目前采取的普遍措施，但抗病果桑品種培育、生物法防治是未來的發展方向。桑椹酒的釀造是一項系統工程，需要具備系統思維的意識，將品質管理轉移到各環節關鍵點的控制。