基于純培養和高通量測序技術解析仙桃地區鲊菜細菌多樣性

胡雨婷，符 漫，王玉榮，張 彥，張海波，孫雅芳，郭 壯*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

鲊菜是指以米粉或玉米粉為原料，以豇豆、冬瓜和蘿卜等各種切碎的蔬菜為輔料，加入食鹽和花椒密封發酵而成的一種傳統發酵食品[1]。鲊菜制作工藝相對簡單，制作環境相對開放，在湖北省仙桃市、天門市、荊門市和潛江市等地區有著廣泛的食用人群。有研究表明，由于受制作原料和當地生態環境的影響，不同地區制作的同一發酵食品可能形成了各自較為獨特的微生物類群[2]，而獨特的微生物類群又對其產品品質的形成及食用安全性具有重要的影響作用[3]。仙桃市位于華中腹地，北依漢水，南靠長江，具有全年氣候溫和、四季分明及無霜期長的特點，得天獨厚的自然條件和地理環境可能使當地制作的鲊菜蘊含了較為豐富和獨特的微生物類群，然而目前關于此方面的研究尚少。

近年來以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術在泡菜[4]、臘肉[5]、腐乳[6]和豆瓣醬[7]等我國傳統發酵食品的微生物多樣性解析中有著廣泛的應用，具有通量高和價格相對低廉的優點[8]。作為華中和西南地區另一特色發酵食品，鲊廣椒亦是以米粉或玉米粉為原料密封發酵而成，與鲊菜的不同之處在于其使用的為二荊條辣椒，在湖北省恩施土家族苗族自治州、宜昌市、荊州市和神農架林區有著廣泛的食用人群[9]。通過采用MiSeq高通量測序技術，王玉榮等[10]對宜昌市當陽地區鲊廣椒細菌群落結構進行了解析，發現乳桿菌屬（Lactobacillus）為其主要優勢細菌屬，且Lactobacillus和普氏菌屬（Prevotella）對鲊廣椒風味的形成具有積極的作用；李娜等[11]對荊州市洪湖地區鲊廣椒的乳酸菌多樣性進行了分析，發現Lactobacillus為其主要乳酸菌屬；席啦等[12]對宜昌市秭歸地區鲊廣椒細菌多樣性進行解析，發現Lactobacillus、戊糖片球菌屬（Pediococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為其優勢菌屬。鲊菜和鲊廣椒作為湖北地區特色發酵食品，雖然在制作原料上存在一定的差異，但其制作工藝具有一定相似性，加之MiSeq高通量測序技術在鲊廣椒微生物類群解析中有了成功的應用，因而將該技術應用于鲊菜的微生物群落結構解析中具有較強的可行性。乳酸菌已廣泛應用于乳制品、肉制品和果汁制品的生產加工中[13]，且對于人體的腸道防御、血糖血脂調節和身體免疫力提升等均具有明顯的作用[14]，是目前食品加工領域使用的主要菌種資源之一。前期研究亦證明鲊廣椒中存在豐富的乳酸菌資源，因而在對鲊菜微生物多樣性進行解析的同時，采用傳統的微生物學手段對鲊菜中蘊含的乳酸菌資源進行收集亦具有積極的意義。

本研究采用純培養和MiSeq高通量測序技術相結合的手段對仙桃地區鲊菜中細菌菌群多樣性進行解析，對其蘊含的乳酸菌資源進行挖掘，在為鲊菜這一特色傳統發酵食品微生物類群解析提供數據支撐的同時，亦可為其后續產業化推動提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從湖北省仙桃市（E112°55′～113°49′，N30°04′～30°32′）城南菜市場、昌盛菜市場和沙嘴橋菜市場采集鲊菜樣品共9個，所有鲊菜的發酵時間在30～40 d之間，制作原料均為大米粉，添加蔬菜均為冬瓜。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA Polymerase和脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術有限公司；MRS合成培養基：北京陸橋技術股份有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：北京索來寶生物技術有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：武漢天一輝遠生物科技有限公司；克隆載體pMD18-T：大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；DG250型厭氧工作站：英國Don Whitley公司；CR21N型高速離心機：日本日立金屬株式會社；1645050基礎電泳儀：美國Bio-Rad公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國ProteinSimple公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鲊菜乳酸菌的分離鑒定

稱取10 g鲊菜樣品于裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，30 ℃振蕩0.5 h，使用MRS培養基于厭氧條件下培養48 h，挑取革蘭氏染色結果為陽性和過氧化氫酶結果為陰性的疑似乳酸菌菌株使用30%甘油保存[15]，-80 ℃備用。

使用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonjum bromide，CTAB）法對疑似乳酸菌菌株中的DNA進行提取[16]，并參照曾維友等[17]的方法對所提取的DNA進行PCR擴增，擴增產物經電泳（120 V，30 min）檢測合格后進行一系列的清潔、連接、轉化和克隆子的鑒定，挑選陽性克隆子送往武漢天一輝生物有限公司測序。測序序列進行拼接并去除引物，在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，統計分離到的乳酸菌數量及鑒定種類。

1.3.2 鲊菜中微生物宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq高通量測序

使用基因組提取試劑盒對鲊菜微生物宏基因組DNA進行提取，置于-20 ℃備用，以宏基因組DNA為模板，使用在前段加入了7個堿基核苷酸標簽（barcode）的338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物，按照WANG Y等[18]的PCR擴增體系和擴增條件對鲊菜樣品中的細菌16S rRNA進行PCR擴增，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測合格的PCR擴增產物于Illumina MiSeq PE300平臺進行高通量測序。

1.3.3 序列質控和生物信息學分析

參照GUO Z等[19]的方法對測序的原始數據進行拼接、質控和以QIIME平臺為依托進行生物信息學分析。即：序列經PyNAST軟件進行標準比對和對齊后選取100%和97%相似度進行兩步UCLUST劃分，從而構建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣，隨后使用Chimera Slayer軟件剔除含有嵌合體的OTU，最后選取代表性序列在核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）進行同源性比對，進而明確鲊菜中微生物類群的分類學地位。

1.3.4 數據處理

使用MEGA 7.0和R軟件相結合的方法對乳酸菌分離株的系統發育樹進行構建，使用Excel 2010軟件對乳酸菌分離株相對含量的子母餅圖進行繪制，使用Origin 2017軟件對鲊菜中平均相對含量＞1.0%的門和屬柱形圖進行繪制，使用R軟件對核心OTU相對含量的熱圖進行繪制。

2 結果與分析

2.1 仙桃地區鲊菜中乳酸菌的分離、鑒定及相對含量分析

本研究通過純培養手段從14 個鲊菜中共分離得到了44 株乳酸菌，在對其16S rRNA基因序列進行PCR擴增、測序和BLAST比對的基礎上，將其與模式菌株混合構建了系統發育樹，結果見圖1。

圖1 鲊菜中乳酸菌分離株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolates in Zha-vegetable

由圖1可知，HBUAS56196等18株菌株被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），HBUAS56207等15株菌株被鑒定為戊糖乳桿菌（L.pentosus），菌株HBUAS56205、HBUAS56208和HBUAS56218被鑒定為黑氏乳桿菌（L.hammesii），菌株HBUAS56206和HBUAS56236被鑒定為消化乳桿菌（L.alimentarius），菌株HBUAS56250被鑒定為棒狀乳桿菌（L.coryniformis），菌株HBUAS56227被鑒定為發酵乳桿菌（L.fermentum），菌株HBUAS56202被鑒定為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），菌株HBUAS56217被鑒定為綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens），菌株HBUAS56224被鑒定為腸膜明串珠球菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株HBUAS56216被鑒定為假腸膜明串珠球菌（L.pseudomesenteroides）。由此可見，仙桃地區鲊菜中乳酸菌分離株主要隸屬于Lactobacillus，累計占總分離株的90.91%。進一步對各乳酸菌分離株的類群構成及其相對含量進行分析，結果見圖2。

由圖2可知，隸屬于Lactobacillus的種包含6 個，為L.plantarum、L.pentosus、L.hammesii、L.alimentarius、L.fermentum和L.coryniformis，分別占總分離株含量的40.91%、34.09%、6.82%、4.55%、2.27%和2.27%；隸屬于Leuconostoc的種包含2 個，分別為L.mesenteroides和L.pseudomesenteroides，均占總分離株含量的2.27%；隸屬于Weissella和Lactococcus的種各有1 個，分別為W.viridescens和L.lactis，均占總分離株含量的2.27%。由此可見，L.plantarum和L.pentosus為仙桃鲊菜中的優勢乳酸菌。大米或玉米等谷物在發酵過程中，L.plantarum的存在能顯著提升谷物的質構、蒸煮及感官品質，并使得其蛋白質、脂肪及灰分含量顯著減少，總淀粉和直鏈淀粉含量顯著增加，同時使糊化黏度和起始糊化溫度降低，糊化焓值增加，從而更有利于谷物品質的提高[20]。本研究發現，仙桃地區鲊菜中含有L.pentosus，有研究指出在發酵過程中該類群菌株具有較強降解亞硝酸鹽的能力[21]。

圖2 鲊菜中乳酸菌分離株相對含量的餅圖Fig.2 Pie plot of relative contents of lactic acid bacteria isolates in Zha-vegetable

2.2 基于門和屬分類水平鲊菜細菌相對含量的分析

本研究進一步對14個鲊菜中微生物基因組進行了提取，在對9 個樣品微生物基因組進行成功提取的基礎上，使用MiSeq高通量技術對其細菌多樣性進行解析。結果發現，9個樣品共產生286 471條高質量的16S rRNA序列，經比對鑒定為7個門、18個綱、32個目、68個科和142個屬，其中不能鑒定到門和屬水平的序列占總序列數的0.87%和19.36%。若在9 個樣品中某一細菌門或屬的平均相對含量≥1.00%，則將其定義為優勢細菌門或屬，鲊菜中優勢細菌門的構成見圖3。

圖3 鲊菜中優勢細菌門的相對含量Fig.3 Relative contents of dominant bacterial phyla in Zha-vegetable

由圖3可知，仙桃地區鲊菜中的優勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為91.97%和7.13%。不同樣品在門水平上細菌類群的構成即存在一定差異，樣品XT2和XT3中Proteobacteria相對含量高達68.62%和72.89%，而其他7 個樣品以Firmicutes為主且平均相對含量高達95.00%以上。為進一步揭示不同樣品間細菌類群的差異，本研究進一步對優勢細菌屬的含量進行解析，結果見圖4。

圖4 鲊菜中優勢細菌屬的相對含量Fig.4 Relative contents of dominant bacterial genera in Zha-vegetable

由圖4可知，鲊菜中優勢細菌屬主要包括Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Pseudomonas和腸桿菌屬（Enterobacter），其中Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella均隸屬于Firmicutes，其相對含量分別為85.03%、3.31%和1.68%；Pseudomonas和Enterobacter隸屬于Proteobacteria，相對含量分別為1.50%和1.05%。Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella均為乳酸菌，累計相對含量高達90.02%，且通過純培養方式獲得了隸屬于上述菌屬的分離株。由此可見，仙桃地區鲊菜中蘊藏著豐富的乳酸菌資源。乳酸菌可以產生多種氨基酸、維生素和酶等活性物質，從而提高和改善發酵食品的營養價值，在發酵過程中通過厭氧發酵產生乳酸和丙酸從而對發酵環境中某些腐敗微生物和致病微生物的生長具有抑制作用[22]。

由圖4亦可知，樣品XT2和XT3中蘊含細菌的多樣性明顯高于其他7 個樣品，其中樣品XT2除含有58.36%的Lactobacillus外，亦含有Enterobacter、Weissella、根瘤菌屬（Rhizobium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Pediococcus和沙雷氏菌屬（Serratia）等細菌，相對含量分別為5.84%、5.03%、4.80%、4.74%、2.42%和1.63%；樣品XT3中Lactobacillus的相對含量僅為25.46%，但其Leuconostoc的相對含量高達29.66%，除此以外亦含有Weissella、Lactococcus、Pseudomonas、穩桿菌屬（Empedobacter）、Enterobacter、漫游球菌屬（Vagococcus）、Klebsiella和塔特姆菌屬（Tatumella），相對含量分別為9.41%、4.83%、3.53%、3.51%、3.15%、1.88%、1.40%和1.10%。經對其α多樣性進行計算發現，在測序深度為14 000條時，樣品XT2和XT3的香農指數分別為4.90和6.38，而其他7個樣品的平均香農指數僅為2.81。Enterobacter[23]、Klebsiella[24]、Serratia[25]和Empedobacter[26]多為條件致病菌，可引起原發性或繼發性的感染，因而樣品XT2和XT3在食用過程中可能存在一定的安全隱患，究其原因可能是在發酵過程中陶壇沒有密封好或原料受到了外界環境的污染[10]。

2.3 核心OTU及其在各樣品中的分布

采用兩步UCLUST對序列進行劃分且去除嵌合體后，本研究共得到了9 230個OTU，若某一OTU在9個樣品中均存在則將其定義為核心OTU。雖然納入本研究的樣品細菌多樣性存在一定差異，但解析不同樣品中共有的細菌類群，對探討發酵食品品質的形成和食用安全性均具有較大的意義[27]。本研究共發現6個核心OTU，其系統發育樹及各OTU在9個樣品中的含量見圖5。

圖5 核心操作分類單元矩陣系統發育樹及其在各鲊菜中的相對含量Fig.5 Phylogenetic tree of core operational taxonomic units and their relative contents in each Zha-vegetable

由圖5可知，6個核心OTU在系統發育樹中整體劃分為2個大類，其中OTU2192、OTU7256和OTU4221隸屬于Lactobacillus，其在9 個樣品的平均相對含量分別為6.59%、1.91%和39.96%；OTU3876、OTU4651和OTU1861隸屬于Pseudomonas，平均相對含量分別為0.02%、0.03%和0.01%。由此可見，Lactobacillus是仙桃地區鲊菜中的主要核心細菌類群。雖然各樣品中Pseudomonas的相對含量較低，但有研究指出該菌株致病力較低但其抗藥性較強，在自然界中廣泛存在，是導致傷口感染的細菌之一[28]。由此可見，在鲊菜制作及發酵過程中，保證環境及發酵器皿的潔凈度、對發生腐敗及霉變的原料及時剔除和保證鲊菜發酵過程中陶壇的密封性是極為必要的[10]。

3 結論

本研究采用傳統微生物學方法和高通量測序技術對仙桃地區14 份鲊菜樣品中細菌菌群多樣性進行了解析，結果發現Firmicutes和Proteobacteria為鲊菜中的優勢細菌門，Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Pseudomonas和Enterobacter為鲊菜中優勢細菌屬，L.plantarum和L.pentosus為鲊菜中主要的乳酸菌類群。