添加白酒對人工接種東北酸菜揮發性風味成分及感官特性的影響

李 瀟，張曉黎，高 雅，韓艷秋，王 琛，吳興壯

（遼寧省農業科學院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

東北酸菜是以白菜或甘藍經發酵制得的鹽漬菜[1]。作為我國東北地區特色食品，酸菜因其獨特的風味、爽脆的口感、濃郁醇厚的酸味和營養保健功效深受消費者喜愛。以酸菜為原料烹制的許多菜肴，也已成為我國北方地域飲食文化的一大特色。目前，隨著現代食品加工技術的不斷發展，酸菜已逐步由傳統的自然發酵向人工接種乳酸菌發酵模式轉變[2]。乳酸菌在酸菜的發酵中起主導作用，通過不同的代謝途徑，豐富的代謝產物在酸菜發酵的過程中被不斷積累，而這些代謝產物可賦予酸菜獨特的風味[3-4]。因此，其常被用作酸菜工業生產中的發酵劑。研究表明，人工接種乳酸菌可縮短酸菜的發酵周期，降低酸菜亞硝酸鹽含量，穩定酸菜質量并且改善酸菜品質[5]。然而，人工接種乳酸菌發酵的酸菜由于菌種單一，代謝產物少于由復雜菌系自然發酵的酸菜，因此在風味上略顯不足[6]。

白酒作為另外一種傳統發酵飲品，豐富的酯類和醇類物質對其飽滿的風味具有重要貢獻[7]。有研究表明，發酵泡菜的過程中添加一些輔料（如白酒），有助于彌補泡菜風味的不足[8]，而在工業生產上，為提高泡菜風味品質，同時避免生產過程中出現生花現象，部分企業也會在泡菜水中添加白酒[9]。然而，中國傳統醬香型、濃香型和清香型白酒具有不同的風味特征與感官屬性。相比于香型較濃的醬香型和香型較清爽的清香型，以乙酯類為風味形成關鍵化合物的濃香型白酒呈現的窖香、花香、果香和甜香的氣味較為適中[10]，更適合作為輔料進行添加。但添加白酒作為輔料對酸菜的風味影響鮮有報道。此外，乳酸菌的生長不可避免會受到乙醇環境的脅迫[11]。研究表明，過高的乙醇濃度會增加乳酸菌細胞膜的通透性，引起胞內物質外流同時影響菌體內酶的活性，進而影響菌體的代謝與生理活性，抑制其生長甚至造成死亡[12-14]。因此為了有效提高乳酸菌在發酵后期生長代謝的穩定性，選育對醇類脅迫穩定的菌種勢在必行。

本研究探究了酸菜中常見的7株乳酸菌的產酸能力與耐乙醇特性，并從中篩選優良性能的乳酸菌復配成發酵劑。將復配的發酵劑對大白菜進行接種發酵，通過添加濃香型白酒，對比不同方式發酵酸菜的揮發性風味物質與感官特性，明確篩選復配的乳酸菌發酵劑的實際應用效果以及白酒對東北酸菜風味與滋味的改善作用，旨在為東北酸菜的品質提升與酸菜發酵劑的研制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LNJ005：遼寧省農業科學院食品與加工研究所；發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）BNCC194390、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）BNCC337373、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）BNCC134415、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）BNCC186447、清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）BNCC192620、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）BNCC194779：自北納創聯生物技術有限公司。大白菜、食鹽和白酒（濃香型，酒精度42%vol）：遼寧省沈陽市農科院綜合市場。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 L，調pH為6.0～6.4。121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養基：在MRS液體培養基中加入24 g/L瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型單人單面工作凈化臺：上海滬凈醫療器械有限公司；CJ50-3疊加式培養箱：上海程捷儀器設備有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；756型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；5975C氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：安捷倫科技有限公司；SA402B型電子舌：日本INSENT公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與稀釋

將植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌的凍干菌粉分別接入20 mL的MRS液體培養基，30 ℃培養24 h。從菌懸液中取0.2 mL接種到20 mL的MRS液體培養基，30 ℃培養24 h。將二次傳代培養的菌懸液進行10倍梯度稀釋（10-4、10-5、10-6、10-7），分別從中取0.2 mL涂布于MRS固體培養基中30 ℃培養48 h。計算乳酸菌菌落總數。

1.3.2 耐乙醇、產酸能力強乳酸菌的篩選

取0.2 mL從二次傳代培養的菌懸液，接入不同乙醇體積分數（1%、2%、4%、6%、8%、10%）的MRS固體培養基中進行涂布，30 ℃培養48 h，測定菌株存活率，篩選耐乙醇能力強的乳酸菌。

存活率Rsur計算公式如下：

式中：Na為未添加乙醇的MRS固體培養基中生長的乳酸菌數，CFU/mL；Nb為添加不同乙醇含量MRS固體培養基中生長的乳酸菌數，CFU/mL。

將對乙醇具有較高耐受性的乳酸菌在體積分數4%乙醇的MRS液體培養基中30 ℃培養24 h。每隔3 h測定菌液pH值，繪制選定乳酸菌在乙醇環境下的酸度變化曲線，篩選產酸能力強的乳酸菌。

1.3.3 人工接種東北酸菜樣品制備及揮發性風味成分、感官特性分析

將篩選出的耐乙醇能力和產酸能力較強的乳酸菌的菌懸液以生理鹽水稀釋到相同濃度（菌體數量級為107CFU/mL）。將耐乙醇能力和產酸能力較強的乳酸菌菌懸液稀釋液等體積混合均勻，制成液體混合菌發酵劑。

大白菜清洗切絲后，添加2%的食鹽，攪拌均勻。隨后將白菜絲裝入塑料泡菜瓶中并壓實。將液體發酵劑加入泡菜瓶中，封口前，向每個泡菜瓶中添加2%的白酒，20 ℃密封發酵30 d。酸菜樣品從泡菜瓶的上、中、下三層收集，并混合均勻，備用[15]。自然發酵得到的酸菜（未添加發酵劑和白酒）編號為NF，植物乳桿菌發酵得到的酸菜編號為L.P，植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌混合發酵得到的酸菜編號為3LAB，3種乳酸菌混合發酵且添加白酒發酵得到的酸菜編號為3L+B。測定4種酸菜的理化、微生物指標并分析其揮發性風味成分及感官特性。

1.3.4 測定方法

可滴定酸：按照參考文獻[16]的方法進行測定。還原糖含量：按照參考文獻[15]的方法進行測定。

揮發性風味物質成分測定：采用頂空固相微萃取-氣質聯用方法（head space-solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）對樣品風味物質進行測定[15]。

樣品處理：取5 g酸菜樣品置于15 mL頂空瓶中，于60 ℃水浴40min，然后插入老化的纖維頭，60℃條件下萃取40min。將萃取好的纖維頭插入GC-MS的進樣口，250 ℃解吸5 min。

氣相色譜條件：Rxi-5Sil MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），高純度氦氣（He）作為載氣，流速為1 mL/min，以1∶3的分流比運行。升溫程序：柱溫35 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至160 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。

質譜條件：離子源溫度為200 ℃。電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，質譜掃描范圍為20～500 m/z。

感官評價：采用衛玲玲等[17]的方法并稍作修改。感官評分標準見表1。

表1 酸菜感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of Suancai

電子舌測定：采用配備酸、苦、澀、鮮、咸5個傳感器的SA402B型電子舌。取自然發酵和添加白酒的人工接種發酵酸菜的發酵液各50 mL于測量杯中，每種樣品重復測定4次。

1.3.5 數據分析

通過“SPSS 20.0”軟件進行方差分析，在P＜0.05水平上進行Duncan檢驗。借助“Excel 2016”軟件進行感官評價的統計與分析。采用“Origin 9.0”軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 耐乙醇乳酸菌的篩選

由表2可知，隨乙醇含量的增加，乳酸菌的存活率均下降。發酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、清酒乳桿菌在乙醇體積分數為6%時，存活率均降至80%以下。表明這3種菌對乙醇的耐受程度較低。由于干酪乳桿菌、短乳桿菌、檸檬明串珠菌和植物乳桿菌在體積分數4%乙醇條件下存活率均＞90%，表明這4種菌對體積分數4%乙醇的耐受程度較高。因此選擇這4種菌進行產酸能力測定。

表2 不同乙醇體積分數對乳酸菌存活率影響Table 2 Effects of different volume fraction of ethanol on the survival rate of lactic acid bacteria

2.2 乙醇對乳酸菌產酸能力的影響

由圖1可知，未添加和添加體積分數4%乙醇的植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和干酪乳桿菌的產酸趨勢基本相同。其中，植物乳桿菌和檸檬明串珠菌在添加乙醇后，分別在生長3 h和15 h時，環境的pH已經達到5以下。而添加乙醇的干酪乳桿菌初期生長平穩，18 h時后pH下降到5以下。相比之下，添加乙醇的短乳桿菌產酸速率較低，生長36 h后環境pH降到5以下。植物乳桿菌產酸速率快，能力強，生長穩定期環境pH達到3.6左右。檸檬明串珠菌前期生長略受抑制，但其產酸速率較快。而干酪乳桿菌中后期產酸速率快，且生長不受體積分數4%乙醇影響。因此可以選擇植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和干酪乳桿菌復配成生長穩定，產酸速率快、能力強的混合發酵劑。

圖1 乙醇對4株乳酸菌產酸能力的影響Fig.1 Effects of ethanol on the acid production ability of 4 lactic acid bacteria

2.3 白酒結合耐乙醇混菌發酵劑對酸菜微生物及理化指標的影響

采用植物乳桿菌、檸檬明串珠菌和干酪乳桿菌混合接種發酵酸菜，單純植物乳桿菌發酵和自然發酵酸菜的菌落總數、可滴定酸含量和還原糖含量見圖2。

圖2 酸菜的菌落總數、可滴定酸和還原糖含量測定結果Fig.2 Determination results the total number of colonies,titratable acid and reducing sugar content of Suancai

通過比較發現，自然發酵的酸菜中包含最多的乳酸菌數為9.22 lg（CFU/mL），而三種菌混合發酵酸菜的乳酸菌數又略少于植物乳桿菌接種發酵的酸菜。這可能是由于外源乳酸菌的添加，尤其是檸檬明串珠菌和植物乳桿菌產酸快，在發酵初期使得發酵環境的pH急劇下降，因此白菜自身或環境中所夾帶的其他部分乳酸菌的生長因急劇的酸性環境變化而被抑制[18]。另一方面，韓宏嬌等[19]認為發酵后期由于營養物質不斷被消耗，導致發酵液中乳酸菌生長所需的碳、氮源不足，因此乳酸菌數減少。雖然發酵劑選用的是耐乙醇的乳酸菌，但添加白酒發酵的酸菜中乳酸菌數仍有所下降，這可能是由于白酒中的其他物質對乳酸菌的生長也有影響。此外，人工接種乳酸菌發酵酸菜的可滴定酸和還原糖含量均高于自然發酵的酸菜。由于接種快速產酸的乳酸菌后，乳酸菌代謝產生大量的乳酸、乙酸、丙酸等有機酸，快速增加了發酵液中可滴定酸的含量[20]。而接種乳酸菌發酵酸菜的還原糖含量較高，一方面由于大量的外源乳酸菌，對蔗糖具有高的利用率，而減少了對葡萄糖和果糖等還原糖的消耗，保留了部分還原糖[21]；另一方面，自然發酵酸菜中更多的微生物利用并消耗了還原糖，而人工接種發酵酸菜的乳酸菌活菌數少，因此代謝消耗的糖量減少，從而人工接種乳酸菌發酵酸菜的還原糖高于自然發酵的酸菜[22-23]。值得注意的是接種發酵的酸菜中，添加白酒的混菌發酵酸菜的可滴定酸含量比未添加白酒的混菌發酵酸菜降低4.02%，比單植物乳桿菌發酵的酸菜降低6.64%。成品過度酸化往往是發酵蔬菜工業生產中的一大難題[24]，而從結果上來看，白酒的添加，降低了乳酸菌發酵酸菜的酸度，這表明白酒的添加可以抑制乳酸菌發酵酸菜的過度酸化，使酸菜口感更加柔和。

2.4 白酒結合耐乙醇混菌發酵劑對酸菜風味及揮發性成分的影響

采用GC-MS對自然發酵酸菜、植物乳桿菌接種發酵酸菜、混菌接種發酵酸菜和添加白酒的混菌發酵酸菜的揮發性風味成分進行分析比較，結果見表3。

表3 不同發酵方式酸菜揮發性風味成分Table 3 Volatile components of Suancai under different fermentation modes

續表

續表

四種發酵方式酸菜的風味物質及揮發性成分有明顯差異。自然發酵的酸菜共檢測出45種物質，而接種植物乳桿菌和混菌發酵的酸菜檢測出的物質均較少，分別為27種和30種。自然發酵酸菜的風味及揮發性物質以醇為主（40.92%），其次是酸（19.09%）、氨基酸（13.08%）和碳氫化合物（8.68%）。接種植物乳桿菌和混菌發酵酸菜的風味及揮發性物質中醇、酯和氨基酸的含量高于自然發酵，而碳氫化合物低于自然發酵酸菜。相比之下，添加白酒并接種混菌發酵的酸菜檢測出42種物質。雖然醇類含量較低（27.34%），但酸、酯和氨基酸的含量較高，分別占總量的6.66%、25.99%和20.80%。含碳數較低的脂肪酸乙酯是酒類的主體成分，具有鮮花及果香[25]，尤其是己酸乙酯與丁酸乙酯是濃香型白酒的主要香味成分，而添加白酒不僅為酸菜增加了低碳脂肪酸的占比，還引入了獨有的己酸乙酯與丁酸乙酯，增加了酸菜的芳香氣味。與接種發酵的酸菜相比，白酒增加了酸菜中乙酸的占比。乙酸具有清爽的米醋香味，能夠增加酸菜的爽口度。然而，白酒的添加，導致了酸菜中酸類物質種類的減少，與氨基酸含量的增加。這與可滴定酸降低的結果一致，也表明白酒可以促進酸類向氨基酸的轉化。此外，添加白酒的酸菜檢測出了自然發酵和接種發酵并未檢測出的酮類和含硫化合物。酮類物質具有濃郁的香味，是酒類風味的重要組成[26]，具有香氣的調節作用。因此添加白酒接種發酵的酸菜中檢測到的新的風味物質結構能夠賦予酸菜獨特的風味特征，而較少種類與含量的醇、呈味酸以及較高含量的氨基酸又能為酸菜呈現新的滋味。

2.5 白酒結合耐乙醇混菌發酵劑對酸菜感官品質的影響

酸菜感官品質評價結果見圖3。從圖3A和圖3B中酸菜的感官評分結果可以看出，自然發酵的酸菜在感官品質上優于僅由乳酸菌接種發酵的酸菜，這一結果在其他相關研究中也得到認證[27]。與單植物乳桿菌發酵的酸菜相比，混合乳酸菌發酵的酸菜在顏色、香氣、味道和口感上均有優勢。而添加了白酒并由混菌發酵劑發酵的酸菜在感官評分上明顯高于僅由乳酸菌接種發酵甚至是自然發酵的酸菜，尤其是在顏色、味道和口感上具有顯著優勢。雖然在香氣品質上稍遜于自然發酵，但也明顯好于僅由乳酸菌接種發酵的酸菜。

圖3 酸菜的感官品質評價結果Fig.3 Sensory quality evaluation results of fermented suancai

由圖3C可知，添加白酒的接種發酵酸菜與自然發酵酸菜相比，酸味和鮮味略有提高。這與可滴定酸含量和風味物質成分的測定結果一致，與自然發酵相比，添加白酒發酵的酸菜的酸類物質和氨基酸占比增加，因此酸味和鮮味提升。此外，白酒結合混菌發酵可以降低酸菜苦味，尤其降低了苦和澀的后味，這與還原糖測定結果一致，添加白酒導致酸菜還原糖含量增加，因此降低了苦味。而苦澀味降低能有效提高品嘗的愉悅感。綜合主觀和客觀的感官評價結果，表明篩選的植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌混合作發酵劑在對改善人工接種單一乳酸菌發酵酸菜的感官品質上具有有效作用，而白酒的添加對于人工接種乳酸菌發酵酸菜的品質的進一步提升具有重要意義。

3 結論

本研究從7種發酵酸菜常用乳酸菌中篩選出3種耐乙醇型乳酸菌，分別為植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌，并復配成發酵劑，用于酸菜的發酵。通過對耐乙醇型復配發酵劑發酵的酸菜的乳酸菌數、可滴定酸含量和還原糖以及感官品質進行分析，耐乙醇型復配發酵劑適用于酸菜的發酵，可以抑制酸菜的后酸化，同時形成以酯、酮、含硫化合物和氨基酸為主的新型風味結構，改善人工接種酸菜的感官品質并顯著提升酸菜的鮮味。該結果為進一步研究人工接種乳酸菌發酵酸菜的風味形成機理提供理論基礎，同時，對乳酸菌發酵酸菜的品質提升和新產品創制提供思路。