高溫大曲中高產四甲基吡嗪芽孢桿菌的分離鑒定及發酵條件優化

王 慶，王超彥，徐海林，向小青，韓國強

（長江師范學院 現代農業與生物工程學院，重慶 408100）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）別名川芎嗪，屬含氮雜環化合物，從川芎中提取獲得，可用于治療心腦血管疾病[1]，具有堅果、花生、榛子、可可香氣[2]。白酒中的四甲基吡嗪賦予白酒中“健康因子”的美譽，是醬香型和芝麻香型白酒的重要香氣成分之一[3]。近年來，國內很多酒企開展了利用加強發酵酒曲及發酵條件優化提高白酒中四甲基吡嗪含量的研究[4-5]。

白酒中的四甲基吡嗪來源于微生物代謝合成，糖降解產生丙酮酸，兩分子的丙酮酸進行縮合反應形成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫羧生成3-羥基丁酮（又稱乙偶姻），乙偶姻進一步與氨經過非酶促反應生成四甲基吡嗪[6]。白酒生產過程中產四甲基吡嗪的微生物多為芽孢桿菌，尤其以枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為主。芽孢桿菌能代謝產生大量具有醬味的吡嗪類物質和酸味的物質[7]，能夠調和酒香，有助于提升大曲白酒的品質[8]。趙興秀等[9]運用稀釋平板涂布法結合固態發酵聞香從大曲中分離得到3株產醬香濃郁的枯草芽孢桿菌；李曉霞等[10]從汾酒大曲中分離得到了3株高產四甲基吡嗪的芽孢桿菌，其中2株為枯草芽孢桿菌，1株為彎曲芽孢桿菌；張溫清等[11]在宣酒大曲中篩選出的高產四甲基吡嗪功能菌株解淀粉芽孢桿菌固態發酵生產麩皮曲，其四甲基吡嗪產量可達202.54 mg/kg。陳夢圓等[12]在高溫大曲中篩選出高產四甲基吡嗪的地衣芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌。趙德義等[13]從中溫大曲中分離篩選到一株產四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌，其四甲基吡嗪產量可達11.42 g/L。

很多研究者將高產四甲基吡嗪的芽孢桿菌用于增強曲中并進行發酵條件的優化，可顯著提高白酒中四甲基吡嗪的含量。王小平等[14]在醬香大曲中獲得3株高產四甲基吡嗪的地衣芽孢桿菌，通過發酵優化，逐級升溫等可顯著提高醬香風味。王西等[15]將從高溫大曲中篩選得到的產香枯草芽孢桿菌應用到醬香型白酒生產中，在堆積之前加入枯草芽孢桿菌，四甲基吡嗪含量明顯提高，感官品質明顯增強。祝賽峰等[16]通過響應面確定枯草芽孢桿菌S0507在最佳培養條件時四甲基吡嗪的產量為332.70 mg/L；王曉丹等[17]在窖池的中層菌株添加量為5%時，糟醅中的四甲基吡嗪產量達6.81 μg/L。周榆林等[18]通過加熱強化工藝制成的高溫大曲醬香突出，酒體醇厚。利用酒糟進行固態發酵可以提高麩曲中的四甲基吡嗪含量[19]。提高乙偶姻的合成能力以及添加銨鹽都能夠顯著提高產物四甲基吡嗪的含量。通過對培養條件和培養基成分進行優化，凝結芽孢桿菌可以獲得2.54 g/L的四甲基吡嗪[20]。馬美榮等[21]將篩選的高產四甲基吡嗪的芽孢桿菌用于清香型白酒可提高原酒中四甲基吡嗪的含量。

本研究從高溫芝麻香大曲中篩選高產四甲基吡嗪的芽孢桿菌，通過形態學觀察、生理生化和分子生物學鑒定高產四甲基吡嗪菌株，再通過兩步發酵策略，發酵第一階段培養條件有利于菌株的生長繁殖和四甲基吡嗪前體物質乙偶姻的合成，發酵第二階段對生產四甲基吡嗪的發酵條件進行優化，旨在獲得菌株高產四甲基吡嗪的發酵條件，深入了解芽孢桿菌高產四甲基吡嗪的發酵特性，為后續利用該菌株制備高產四甲基吡嗪的復配曲提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

洪昊牌芝麻香型高溫大曲：梁山洪昊制曲廠。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉、氯化鈉、甲基紅、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；四甲基吡嗪、無水乙醇（均為色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：上海生物工程有限公司；Voges-Proskauer（V-P）試劑：青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

分離培養基采用營養肉湯培養基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，調節pH為7.0，121 ℃高壓滅菌15 min。營養肉湯固體培養基中加入20 g/L的瓊脂。

種子培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

發酵培養基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，葡萄糖100 g/L，磷酸氫二銨30 g/L，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；UB203i顯微鏡：重慶澳浦光電技術有限公司；Sigma 1-14K小型冷凍離心機：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；ZHJHC1112C超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；LRHS-150-II恒溫恒濕培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；GI54DWS高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲中芽孢桿菌的分離純化

樣品處理：稱取大曲10 g，于三角瓶中加入已滅菌的生理鹽水90 mL，振蕩30 s后37 ℃、180 r/min搖床過夜培養。菌液置于水浴鍋中80 ℃水浴20 min，滅活營養細胞，將處理過的菌懸液分別稀釋成10-4，10-5，10-6，10-7，各取0.1 mL在平板上涂布，每個稀釋度做3個平行，37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養2 d，觀察菌落形態，將形態不同的單菌落挑出重新劃線接至固體平板上繼續培養，直到分離純化得到單菌落，菌株于-80 ℃條件下超低溫保藏。

1.3.2 高產四甲基吡嗪菌株的初篩

四甲基吡嗪的前體物質乙偶姻在堿性條件下被氧化為2,3-丁二酮，而后與肌酸產生粉紅色復合物。通過V-P實驗對菌株發酵液中乙偶姻進行初步檢測，實現對產四甲基吡嗪菌株的初篩。

將純化的菌種分別接入裝液量為5 mL/45 mL的種子培養基中，37 ℃、200 r/min培養12 h，得到菌株種子液。將種子液按照4%接種量接入裝液量為5 mL/45 mL發酵培養基內，37 ℃、200 r/min培養36 h，得到菌株發酵液。取1 mL菌株發酵液，加入V-P試劑振蕩混勻，放置5 min，觀察顏色變化，選取反應后顏色變為紅色的菌株進行高產四甲基吡嗪菌株的復篩。

1.3.3 高產四甲基吡嗪菌株的復篩

將經過初篩的菌株接至裝液量為30 mL/250 mL液態發酵培養基中，37 ℃、200 r/min培養48 h，得到菌株發酵液。取發酵液在8 000 r/min條件下離心10 min，取2 mL樣品稀釋液中加入2 mL二氯甲烷靜置過夜萃取，取萃取下相經0.22 μm有機膜過濾，用于氣相色譜儀測定TTMP的含量，復篩高產四甲基吡嗪菌株。

1.3.4 四甲基吡嗪含量的檢測

四甲基吡嗪含量的檢測采用氣相色譜法。稱取四甲基吡嗪的標準品，溶解于無水乙醇中，稀釋配制成1 g/L的四甲基吡嗪標準溶液。氣相色譜條件：進樣量1 μL；進樣口溫度250 ℃；毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.2 μm）；升溫程序：起始溫度60 ℃，恒溫5 min，以5 ℃/min程序升溫至200 ℃，繼續恒溫10 min；載氣為高純氮氣（N2），流速為1.0 mL/min，分流比20∶1；氫氣流速為40 mL/min；空氣流速為400 mL/min；尾吹氣30 mL/min；氫火焰離子化檢測器（flame ionization ditector，FID）溫度：240 ℃。根據出峰時間進行定性，采用外標法定量[22]。

1.3.5 高產四甲基吡嗪菌株的鑒定

（1）形態學觀察

將菌株劃線轉接到營養肉湯培養基中，37 ℃條件下培養36 h后觀察其在營養肉湯平板上的顏色、大小、表面光滑性等菌落形態特征。將菌株制片，通過革蘭氏染色進行鏡檢，在100倍顯微鏡下觀察細胞形態。

（2）生理生化試驗

依照《伯杰細菌鑒定手冊》和《微生物學試驗》對菌株進行生化特性試驗。

（3）分子生物學鑒定

通過DNA提取試劑盒提取高產四甲基吡嗪菌株的基因組DNA，以其為模板利用細菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）：基因組DNA模板2.5 μL，引物27F 2.5 μL，引物1492R 2.5 μL，2×PCR Mix 25 μL，超純水補足至50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；然后95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環34次；最后72 ℃延伸10 min，降溫至4 ℃保存。PCR產物交由華大基因股份有限公司進行測序鑒定，測序結果通過美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行同源性比較，利用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.3.6 菌株產四甲基吡嗪后發酵條件優化

菌株生產四甲基吡嗪分為兩個發酵階段進行，第一階段為四甲基吡嗪前體物質乙偶姻合成階段，第二階段為四甲基吡嗪生產階段。首先將斜面菌種取一環接種至種子培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜，接種1 mL種子液至裝液量為30 mL/250 mL的發酵培養基中，37 ℃、200 r/min培養72 h。第一階段發酵結束后對四甲基吡嗪生產的后培養階段發酵條件進行優化。

后發酵溫度的確定：后發酵溫度分別為45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃，200 r/min培養24 h，測定四甲基吡嗪產量。

后發酵時間的確定：后培養溫度60 ℃，200 r/min培養，培養時間5 h、10 h、15 h、20 h、25 h，測定四甲基吡嗪含量。

培養基初始pH的確定：液體發酵培養基初始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，后培養溫度60 ℃，200 r/min培養20 h，測定四甲基吡嗪的產量。

銨鹽添加量的確定：后培養階段分別補加1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的（NH3）2HPO4溶液，60 ℃、200 r/min培養20 h，測定四甲基吡嗪的產量。

2 結果與分析

2.1 產TTMP芽孢桿菌的篩選

通過V-P實驗進行初篩，得到20株呈陽性反應且紅色較深的產四甲基吡嗪菌株，分別編號為WH1～WH20。其TTMP產量測定結果見圖1。

圖1 篩選菌株四甲基吡嗪的產量測定結果Fig.1 Determination results of tetramethylpyrazine yield of screened strains

由圖1可知，TTMP產量最高的3株菌編號為WH7、WH10、WH20，TTMP產量分別是235.46 mg/L、272.15 mg/L、173.57 mg/L，將菌株WH7、WH10、WH20進行鑒定。

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1 篩選菌株的菌落形態和細胞形態

菌株WH7、WH10、WH20菌落及細胞形態見圖2。

圖2 菌株WH7、WH10及WH20的菌落形態（a、b、c）和細胞形態（d、e、f）Fig.2 Colony morphology (a,b,c) and cell morphology (d,e,f) of strain WH7,WH10 and WH20

由圖2可知，菌株WH7、WH10、WH20的菌落特征較為相似，白色，圓形，邊緣較整齊，不透明，表面光澤濕潤。菌株WH7、WH10、WH20經革蘭氏染色觀察后屬于革蘭氏陽性菌，短桿狀，菌體兩端鈍圓。

2.2.2 篩選菌株的生理生化試驗

對菌株WH7、WH10、WH20進行生理生化鑒定，結果表明，菌株WH7、WH10、WH20在3%過氧化氫溶液中均產生氣泡，表明這三株菌都能產生過氧化氫酶，是需氧菌；在淀粉水解試驗中均產生不變色透明圈，表明菌株WH7、WH10、WH20能夠利用淀粉。進行檸檬酸鹽試驗時，培養基均由綠色變為藍色，證明菌株WH7、WH10、WH20能利用檸檬酸鹽。

2.2.3 篩選菌株的分子生物學鑒定

菌株WH7、WH10及WH20的系統發育樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA序列菌株WH7、WH10和WH20的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains WH7,WH10 and WH20 based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株WH7和WH20菌株與副淀粉芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）聚集在了同一個分支上，同源性99.78%；菌株WH10與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）聚集在了同一個分支上，同源性98.86%。因此，菌株WH7和WH20被鑒定為副淀粉芽孢桿菌（Bacillus paramycoides），菌株WH10被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.3 菌株WH10產四甲基吡嗪發酵條件優化

2.3.1 后發酵溫度對四甲基吡嗪產量的影響

高溫有利于四甲基吡嗪的合成，醬香型白酒的獨特工藝高溫制曲和高溫堆積是導致醬香型白酒中四甲基吡嗪含量較高的重要原因[18]。后發酵溫度對四甲基吡嗪合成的影響，結果見圖4。由圖4可知，隨著后發酵溫度在45～60 ℃范圍內的的升高，四甲基吡嗪的產量有所升高；后發酵溫度在60 ℃下培養四甲基吡嗪的產量最高，達到537.61 mg/L；后發酵溫度＞60 ℃之后，四甲基吡嗪的產量有所下降。因此，最佳后發酵溫度為60 ℃。

圖4 后發酵溫度對四甲基吡嗪產量的影響Fig.4 Effect of post-fermentation temperature on tetramethylpyrazine yield

2.3.2 后發酵時間對四甲基吡嗪產量的影響

由圖5可知，后發酵時間在0～20 h范圍內，隨著后培養時間的延長，四甲基吡嗪產量逐漸升高；后發酵時間在20 h時，四甲基吡嗪產量最大，達到557.26 mg/L；后發酵時間超過20 h之后，四甲基吡嗪的產量反而降低。其主要原因是四甲基吡嗪與2,3-丁二醇都由乙偶姻生成，兩者存在競爭機制，乙偶姻與四甲基吡嗪是可逆反應，在高溫有銨鹽的條件下，乙偶姻主要生成四甲基吡嗪[2]；但隨著時間的延長，反應更有利于由乙偶姻向TTMP的競爭產物2,3-丁二醇的轉化，故四甲基吡嗪產量有所降低[6]。因此，最佳后發酵時間為20 h。

圖5 后發酵時間對四甲基吡嗪產量的影響Fig.5 Effect of post-fermentation time on tetramethylpyrazine yield

2.3.3 初始pH值對四甲基吡嗪產量的影響

初始pH值對四甲基吡嗪合成的影響，結果見圖6。由圖6可知，在培養基初始pH值為5.5～6.5時，隨著初始pH值的升高，四甲基吡嗪產量隨之增加；當初始pH值為6.5時，四甲基吡嗪產量最高，達到557.42 mg/L；初始pH值＞6.5之后，四甲基吡嗪有所下降，說明初始pH對菌株產四甲基吡嗪影響較大。初始pH通過影響菌株的生長和代謝，以及酶的活性來影響最終四甲基吡嗪的產量[23-25]。因此，最佳培養基初始pH值為6.5。

圖6 初始pH值對四甲基吡嗪產量的影響Fig.6 Effect of initial pH on tetramethylpyrazine yield

2.3.4 銨鹽添加量對四甲基吡嗪產量的影響

乙偶姻與氨在高溫條件下通過非酶促反應生成四甲基吡嗪[6]。作為四甲基吡嗪合成的原料，銨鹽的添加對四甲基吡嗪的合成至關重要。銨鹽添加量對四甲基吡嗪合成的影響，結果見圖7。由圖7可知，當補加0～4 g/L銨鹽時，四甲基吡嗪產量升高；當補加4 g/L銨鹽時，四甲基吡嗪產量最大，達到728.38 mg/L；在補加銨鹽＞4 g/L之后，四甲基吡嗪產量反而有所降低。因此，最佳銨鹽添加量為4 g/L。

圖7 銨鹽添加量對四甲基吡嗪產量的影響Fig.7 Effect of ammonium salt addition on tetramethylpyrazine yield

3 結論

通過稀釋涂布法，從高溫大曲中分離獲得20株可產四甲基吡嗪的能力的芽孢桿菌。在發酵培養基中，有3株相對高產四甲基吡嗪的菌株（WH7、WH10和WH20），其四甲基吡嗪產量分別為235.46 mg/L、272.15 mg/L、173.57 mg/L。結合菌株形態學觀察和分子生物學方法，菌株WH7和WH20為副淀粉芽孢桿菌（Bacillus paramycoides），菌株WH10為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。菌株WH10產TTMP發酵條件為：前發酵溫度及時間分別為37 ℃、72 h，后發酵溫度60 ℃，發酵時間為20 h，初始pH 6.5，銨鹽添加量為4 g/L，在此優化條件下，TTMP產量為728.38 mg/L。