紫色紅曲霉固態發酵三七渣生產紅色素的動力學研究

譚顯東，吉栗漫，黃 凡，陳 楠

（成都信息工程大學 資源環境學院，四川 成都 610225）

隨著人們生活水平的不斷提高，健康飲食也越發受到關注。作為一種天然色素，紅色素具有抗炎、抗癌、預防和治療糖尿病、調節膽固醇等功效[1]，與人工合成的色素相比，紅色素具有“天然、營養、多功能”等優點，符合人們對食品著色的健康環保要求，市場需求量較大。三七渣是傳統中藥三七經提取皂苷等有效成分后的殘余物，富含淀粉、蛋白質、多糖等營養元素，適合作為發酵基質使用。采用紫色紅曲霉固態發酵三七渣生產紅色素，不僅可以實現三七渣的資源化利用、減少固體廢棄物污染，還能降低生產成本。發酵動力學的主要任務是研究微生物生長、基質消耗以及產物生成之間的動態定量關系[2-3]，通過發酵動力學的研究，有助于深入了解微生物的生長代謝規律、建立合理的發酵工藝或對已有的發酵過程進行優化[4]。由于固態發酵基質成分不均勻且缺乏自由水，再加上固體顆粒傳導性較差，因此，對發酵過程的生物量、pH值、溫度等培養參數的控制難度較大[5]，相應的微生物生長動力學及傳質模型研究較少，制約了固態發酵生物反應器的可控操作[6]。本研究通過分析紫色紅曲霉固態發酵三七渣生產紅色素過程中相關參數隨發酵時間的變化情況，考察了紫色紅曲霉新陳代謝活動的固有反應速率，并建立了微生物生長動力學、基質消耗動力學以及產物生成動力學模型，以期為反應器放大設計和工業化應用提供基礎參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）（SICC3.19）：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；三七渣：成都市某制藥廠，經晾曬后置于熱風循環烘箱中80 ℃干燥72 h后粉碎、過篩，置于干燥器中備用，該藥渣主要成分為粗淀粉33.13%，粗蛋白12.28%，真蛋白9.97%，還原糖1.37%[7]。

磷酸氫二鉀、三氯乙酸、羧甲基纖維素鈉、冰乙酸、乙酸鈉、蒽酮、高氯酸、無水乙醇、乙酸鉛、苯酚、亞硫酸氫鈉、石油醚、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid,DNS）（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：取20.0 g新鮮土豆、2.0 g葡萄糖、2.0 g瓊脂粉與100 mL蒸餾水混合制備PDA培養基，121 ℃滅菌30 min；種子液培養基：6.0 g葡萄糖、2.0 g蛋白胨、1.0 g硝酸鈉、0.5 g MgSO4·7H2O、1.0 g KH2PO4，蒸餾水100 mL，pH 自然，121 ℃滅菌30 min；三七渣固體培養基：取10.00 g三七渣，0.03 g蛋白胨、0.02 g KH2PO4，加入適量蒸餾水，調整培養基初始水含量為65.17%，pH值自然，121 ℃滅菌40 min。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外可見分光光度計：日本SHIMADZU公司；PYX-280H-C恒溫恒濕生化培養箱：廣東韶關科力實驗儀器有限公司；LDZX-50KB高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SF-130中藥分析研磨機：長沙中南制藥機械廠；QYC-211水浴恒溫振蕩器：上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

用打孔器在PDA培養基的邊緣取0.5 cm2的紅曲霉菌絲塊，將其接入盛有100 mL種子液培養基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩器中，在150 r/min、30 ℃條件下培養5 d。

1.3.2 發酵動力學實驗

取120個250 mL錐形瓶，每個錐形瓶中分別裝入三七渣固體培養基，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接入150 mL/kg的紫色紅曲霉種子液，30 ℃恒溫發酵培養20 d。發酵培養期間，每天取出6個錐形瓶，從其中3個錐形瓶中分別取1.0 g發酵培養物（濕物料）用于測定pH值，然后將這3個錐形瓶中剩余的發酵培養物在60 ℃條件下烘干至質量恒定，粉碎過60目篩后用于淀粉含量、生物量的測試，將其余3個錐形瓶中的發酵培養物在60 ℃條件下烘干至質量恒定，粉碎過60目篩后用于紅色素、還原糖和總糖含量的測試。每個實驗結果均為3個平行樣測定結果的均值。

1.3.3 測定方法

紅色素的測定：準確稱取1.00 g發酵培養物置于250 mL帶塞錐形瓶中，加入50 mL體積分數為70%的乙醇溶液，60 ℃水浴提取60 min，于波長500 nm處測定其吸光度值[8]。

生物量的測定：按照參考文獻[9]的方法測定，通過測定的核酸量來反映生物量。

pH值的測定：稱取1.00 g發酵濕物料，加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻后靜置20 min，用PHS-3C型精密pH計測定其pH值。

淀粉的測定：采用酸水解法[10]。

總糖和還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[11]。

1.3.4 菌體生長動力學模型建立

目前，固態發酵系統大多數采用線性、指數和對數方程研究其動力學，線性方程和指數方程是將微生物生長曲線分為不同階段，并針對不同的生長階段采用不同的方程進行描述，而對數方程的數學表達式比較簡單，用一個方程式就可以近似表示包括適應期、對數期和穩定期在內的生長曲線，所以使用也最廣[5，12-17]。本研究采用Origin9.0軟件內置的非線性方程Slogistic 3（公式1）對發酵培養物中紫色紅曲霉生物量隨發酵時間變化的實驗數據進行擬合。紫色紅曲霉生物量計算公式如下：

式中：X為t時刻紫色紅曲霉生物量，g/g發酵培養物；X0為0時刻的生物量，g/g發酵培養物；Xm為最大生物量，g/g發酵培養物；t為發酵時間，d；α為比增長速率常數，d-1。

1.3.5 產物生成動力學模型

微生物產物形成的動力學模型一般可分為生長偶聯型（或稱伴隨生長的產物形成模型）、部分生長偶聯型（或稱不完全伴隨生長的產物形成模型）、非生長偶聯型（或稱不伴隨生長的產物形成模型）三種。以前文獻大多采用Luedeking-Piret方程研究真菌細胞生長和產物形成的過程[18-19]。由于紅色素的動態變化呈“S”形曲線，因此，本研究嘗試采用Origin 9.0軟件內置的非線性方程Boltzmann（公式2）對發酵培養物中紅色素色價隨時間變化的實驗數據進行擬合。紅色素色價計算公式如下：

式中：t為發酵時間，d；B1為t=0時發酵培養物中紅色素色價，U/g；B2為發酵培養物中紅色素色價最大值，U/g；t0為發酵培養物中紅色素色價增加到最大值一半時所需要的時間，d；t為發酵時間，d；α為兩條漸近線的差值和拐點處“S”形曲線切線斜率比值的1/4，反映了紅色素的合成速率。

1.3.6 基質降解動力學模型

本研究采用Origin 9.0軟件里的四參數對數模型對發酵培養物中總糖含量隨時間變化的實驗數據進行擬合?？偺呛坑嬎愎饺缦拢?/p>

式中：D為t時刻發酵培養物中總糖含量，%；t為發酵時間，d；D2為發酵末期（t=20 d）發酵培養物中總糖含量，%；D1為發酵初期（t=0 d）發酵培養物中總糖含量，%；t50%表示以D2為基準的總糖消耗半衰期，d；q為無量綱常數。

2 結果與分析

2.1 紫色紅曲霉生物量、紅色素色價、發酵培養物pH值的動態變化

發酵過程中紫色紅曲霉生物量、紅色素色價、發酵培養物pH值的動態變化見圖1。

圖1 發酵過程中生物量、紅色素色價、發酵培養物pH值的動態變化Fig.1 Dynamic changes of biomass,color value of red pigments and pH of fermentation culture during fermentation

由圖1可以看出，發酵過程中生物量、紅色素色價、發酵培養物的pH值的動態變化趨勢整體相似，都是在發酵初期變化平緩，幾天以后快速增長，在到達峰值后又基本維持穩定，呈“S”型曲線：發酵前2 d是適應期，然后是對數生長期，第6天開始進入了穩定期，這與普通微生物生長周期的變化規律一致，而且生物量與紅色素色價基本上同時到達峰值，可以認為菌體生長與代謝產物生成具有偶聯性，馬超[20]采用BP神經網絡建立紅曲霉固態發酵過程中生物量、總糖含量、紅曲色素含量的發酵動力學模型，與本研究結果基本一致。顧玉梅等[21]以玉米淀粉和谷氨酸單鈉鹽為主要成分通過紅曲霉9903進行液態發酵產紅色素及桔霉素，發現色素的生產與菌體生長有一定的偶聯關系。但其他一些研究結果卻有所不同：如程新等[14]在采用紅曲霉JR搖瓶分批補料發酵動力學模型的研究中發現，紅曲色素發酵屬于部分生長偶聯型。邵偉等[18]在紅曲霉分批發酵生產紅色素的研究中，發現該發酵過程屬于非生長偶聯型。信亞文等[19]采用連續補料的Fed-Batch培養技術用于紅曲霉菌的液相培養，發現紅曲色素合成與紅曲霉菌生長的關系也屬于非生長偶聯型。衣珊珊[22]在采用紫甘薯淀粉液態發酵制備紅曲色素的研究中發現，紅曲霉菌體干質量只與胞內色素產量之間呈高度正相關（r=0.984 4），與胞外色素間不存在這種相關性。由圖1可以看出，與生物量、紅色素色價相比，發酵培養物的pH值延遲2 d左右到達峰值，且一直保持穩定，但在液態發酵產紅色素的研究中卻發現，pH值先下降后上升[22]。

2.2 總糖、淀粉和還原糖含量的動態變化

發酵過程中總糖、淀粉與還原糖含量的動態變化見圖2。

由圖2可以看出，發酵前2 d，紫色紅曲霉處于適應期，對營養物質消耗很少，總糖含量基本保持不變，隨后總糖含量迅速降低，這是由于在對數生長期大量總糖用于合成紫色紅曲霉細胞生長、紅色素合成以及為其生長代謝提供能量；到第6天后總糖含量基本保持穩定，這與圖1中菌體生長規律完全吻合；淀粉含量的變化趨勢與總糖含量變化趨勢總體相似，但是淀粉含量在發酵前4 d基本保持不變，可能原因在于三七渣中存在比淀粉更容易利用的碳源，比如小分子的單糖和雙糖，優先被紫色紅曲霉利用，發酵第3～4.5天淀粉含量下降最快，隨后降速變緩直到發酵第8天后趨于穩定。還原糖含量在發酵第4天達到峰值，然后快速下降，4.5 d以后降速放緩，6.5 d以后趨于穩定；結合淀粉含量的變化趨勢，可以認為，發酵前3 d還原糖的積累主要來自于其他比淀粉更容易水解利用的碳源，隨后1.5 d淀粉大量水解產生還原糖供給菌體對數生長期所需。在固態發酵三七渣生產蛋白飼料時，總糖、還原糖、淀粉含量的變化規律與本研究結果相似[23-24]。利用鼠李糖乳桿菌生產L-乳酸時，在發酵過程中也觀察到了類似的還原糖變化趨勢[25]。發酵初期三七渣中總糖含量與淀粉含量相差3%，但在發酵后期這一差值擴大到了8%左右，說明淀粉是發酵過程中被主要利用的碳源。

圖2 發酵過程中總糖、淀粉與還原糖含量的動態變化Fig.2 Dynamic changes of total sugar,starch and reducing sugar contents during fermentation

2.3 菌體生長動力學模型

紫色紅曲霉生物量隨發酵時間變化的擬合曲線見圖3，相關模型參數及統計參數見表1。

圖3 菌體生長擬合曲線Fig.3 Fitting curve of cell growth

由表1和圖3可以看出，實驗數據和擬合曲線的相關性較好，符合統計檢驗要求，菌體生長動力學模型如下：由此可以得出，比生長速率常數μ=0.457 4 d-1，最大菌體生物量Xm=0.241 6 g/g發酵培養物（干基）。

表1 菌體生長動力學模型參數Table 1 Parameters of cell growth kinetics model

2.4 產物生成動力學模型

紅色素色價隨發酵時間變化的擬合曲線如圖4所示，相關模型參數及統計參數見表2。

圖4 產物生成擬合曲線Fig.4 Fitting curve of product generation

由表2可知，用Boltzmann模型可以很好地擬合產物生成過程，符合統計檢驗要求，產物生成動力學模型如下：

表2 產物生成動力學模型參數Table 2 parameters of product generation kinetic model

由圖4可知，紅色素色價達到最大值一半時需要的發酵時間t0=4.21 d，最大紅色素色價B2=14.63 U/g發酵培養物（干基）。

2.5 基質降解動力學模型

總糖含量隨發酵時間變化的擬合曲線如圖5所示，以總糖表示的基質降解動力學模型參數及統計參數見表3。

由表3和圖5可以看出，用四參數對數模型可很好地擬合基質降解過程，符合統計檢驗要求，基質降解動力學模型如下：

表3 基質降解動力學模型參數Table 3 Parameters of substrate degradation kinetics model

圖5 總糖降解擬合曲線Fig.5 Fitting curve of total sugar degradation

由此可以看出，發酵末期發酵培養物（干基）中總糖含量D2=28.84%，總糖消耗的半衰期t50%=3.536 d。

3 結論

本研究對紫色紅曲霉固態發酵三七渣生產紅色素的動力學進行了研究，建立了菌體生長、產物生成以及基質降解動力學模型。研究結果表明：采用對數模型對菌體生長動力學進行描述，每克發酵培養物（干基）中最大菌體生物量Xm=0.241 6 g，比生長速率常數μ=0.457 4 d-1；產物生成動力學適合采用Boltzmann模型進行描述，發酵培養物（干基）中最大紅色素色價B2=14.63 U/g，紅色素色價達到最大值一半時需要的發酵時間t0=4.21 d；基質降解動力學適合采用四參數對數模型進行描述，發酵末期發酵培養物（干基）中總糖含量D2=28.84%，總糖消耗的半衰期t50%=3.536 d。