抑制HDAC6可增強自噬減輕腎臟缺血再灌注損傷

鄧芳靜 朱杰夫 吳雄飛

腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemic reperfusion injury,RIRI)是指腎臟血流中斷后,血流恢復反而引起腎功能不全和組織損傷加重的現象,是導致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一。 組織損傷的程度與血流減少的程度和缺血的持續時間有關。 RIRI 是器官移植、休克、膿毒癥、燒傷、心血管疾病和創傷患者常見的并發癥之一[1～3]。 目前認為,組織缺血和隨后的再灌注導致受影響組織的各種代謝改變,包括細胞三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平的降低,細胞內和線粒體鈣水平的增加,活性氧的產生,內質網應激,炎癥損傷作用,細胞凋亡和壞死等[2～5]。 近年來研究發現,自噬和表觀遺傳學也參與了腎臟缺血再灌注損傷。

自噬由一系列高度保守的細胞自噬相關蛋白(autophagy-related proteins,ATGs)參與并受多種信號通路調控的過程。 自噬可以通過降解錯誤折疊或聚集的蛋白質,清除受損的細胞器(如線粒體、內質網和過氧化物酶體)以及消除細胞內病原體,維持機體內環境平衡。 自噬包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬,所有這些都促進溶酶體中胞質組分的蛋白水解降解[6,7]。 自噬是一個復雜的過程和調控機制,在生理和病理條件下都具有重要意義。 隨著研究的不斷深入,自噬功能障礙與多種疾病發生、發展都有關,如衰老、惡性腫瘤、神經病變、腦卒中等[8～11]。研究發現,腎臟基礎自噬對于維持腎臟穩態、結構和功能至關重要。 自噬在腎臟疾病的發生、發展中發揮著重要的作用,激活自噬可減輕腎臟損傷[12,13]。

表觀遺傳學是指在不改變DNA 序列的前提下,通過某些機制引起可遺傳的基因表達或細胞表型的變化,其中包括乙酰化、甲基化、磷酸化、磺酰化、泛素化、羰基化和糖基化。 組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs) 介導乙酰化和去乙酰化[15]。 HDAC6 是組蛋白去乙酰化酶家族成員之一,含有兩個N 端去乙酰化結構域、1 個C 端泛素結合結構域、1 個強核輸出信號、8 個連續重復的十四肽[16]。HDAC6 可以使組蛋白和非組蛋白去乙酰化。 微管具有從維持細胞形態到亞細胞轉運,細胞信號轉導,細胞遷移和細胞極性形成的重要功能。 微管對于各種生物過程至關重要,如炎癥、免疫反應、學習和記憶等。 微管參與了自噬體的形成、自噬體在細胞質中的運輸以及自溶體的形成。 微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成的異二聚體。 α-微管蛋白在自噬中起重要作用。 α-微管蛋白受到各種共價修飾,其中一種修飾是微管蛋白乙酰化,它與穩定微管結構相關。 在哺乳動物中,其乙酰化水平主要由α-微管蛋白乙酰轉移酶1 和HDAC6 控制[6,14]。 HDAC6 能與微管結合,除去α-微管蛋白中的乙酰基殘基,介導α-微管蛋白乙酰化,從而調節微管結構并保持微管完整性[7]。 HDACs 功能異常與腫瘤、神經退行性疾病、炎性反應性疾病、腎臟疾病等諸多疾病發生、發展關系密切[6,15,17,18]。 目前,HDAC6 參與腎臟缺血再灌注損傷作用的潛在機制尚不清楚。 本研究中筆者試圖驗證HDAC6 調控自噬參與了腎臟缺血再灌注損傷,為治療缺血再灌注損傷提供參考依據。

材料與方法

1.主要材料：小鼠腎小管細胞BUMPT 購自中南大學湘雅醫學院;胎牛血清購自中國四季青公司;高糖培養基購自美國Hyclone 公司;TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司;反轉錄試劑盒購自中國Servicebio公司;GAPDH 抗體(貨號：10494-1-AP)購自中國Proteintech 公司;acetylated tubulin(Lys40) Monoclonal antibody(貨號：66200-1-lg) 購自中國Proteintech公司;HDAC6 抗體(貨號：ab207612)購自英國Abcam公司;ATG7 抗體(貨號：DF6130)購自中國Affinity 公司;Beclin-1 抗體(貨號：T55092) 抗體購自中國Abmart 公司;LC3 抗體(貨號：3868)抗體購自美國CST 公司;CCK-8 溶液購自中國Servicebio 公司;PE AnnexinⅤ雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自中國安特捷公司。

2.細胞培養：將BUMPT 細胞分為4 組：正常對照組、正常加TA 組、缺氧復氧組、缺氧復氧加TA組。 BUMPT 細胞用含有10% FBS,1% 青霉素和鏈霉素的高糖培養基,在37℃含5% CO2和95% 的空氣培養箱中培養。 用ATP 耗竭方法制作細胞缺氧復氧模型。

3.動物：體質量為20 ～25g 的雄性C57BL/6 小鼠(購自三峽大學)喂養在提供食物和水的12h∶12h的光/暗循環環境中。 12 只小鼠隨機分為對照組(n=6)和缺血再灌注組(n=6)。 缺血再灌注組采用雙側腎動脈夾閉28min 再灌注24h 的方法建立腎IRI小鼠模型,即戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,開腹暴露腎臟,夾閉雙側腎蒂,當腎臟由鮮紅色變為紫黑色為缺血成功;28min 后恢復血流,由紫黑色變為鮮紅色為再灌注成功。 本實驗已通過筆者醫院動物倫理審批[倫理號：WDRM 動(福)第202110707號]。

4.組織學檢查：將腎臟固定在4%的多聚甲醛溶液中,在一系列不同濃度的乙醇中脫水,石蠟包埋。將石蠟塊切成4μm 切片,HE 染色,光鏡下放大200倍進行形態學分析。

5.RNA 提取和RT-qPCR 法：按照TRIzol 試劑使用說明書從腎臟中提取總RNA,并使用反轉錄試劑盒將1000ng 總RNA 反轉錄為cDNA。 根據試劑盒使用說明書操作,使用UltraSYBR 混合物進行PCR檢測。 采用兩步法PCR,程序設定：95℃變性15s、60℃延伸1min,共40 個循環。 以GAPDH 基因作為內參,通過2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。HDAC6 引物序列：上游引物：5'-TTATGCCCACCTCACCCACCTAC-3',下游引物：5'-GCGATGGACTTGGATGACCTCAC-3'。 GAPDH 引物序列：上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3',下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。 實驗獨立重復3 次。

6.蛋白提取和Western blot 法檢測：將細胞裂解,提取總蛋白。 采用BCA 法測定蛋白質濃度。 通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,然后經電泳將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,封閉后將膜與一抗GAPDH 抗體(1 ∶20000)、HDAC6 抗體(1 ∶1000)、acetylated tubulin(Lys40) Monoclonal antibody抗體(1 ∶1000)、ATG7 抗體(1 ∶1000)、LC3 抗體(1 ∶1000)、Beclin-1 抗體(1 ∶1000)在4℃下孵育過夜,洗膜后加入二抗溶液在室溫下孵育60min,使用ECL化學發光試劑盒顯影。 采用Image J 軟件對蛋白條帶進行灰度分析并對蛋白進行半定量計算。

7.CCK-8 法檢測細胞增殖：將對數期BUMPT細胞接種在96 孔板中,每組設置6 個復孔。 在貼壁生長1 天后,細胞缺氧復氧后加入CCK-8 溶液,繼續孵育2h,用酶標儀檢測各孔在450nm 波長處的吸光度值,以吸光度值代表細胞增殖水平。

8.流式細胞儀檢測細胞凋亡率：將各組BUMPT細胞接種于6 孔板內,培養過夜后給予各組相應處理后,嚴格按照PE AnnexinⅤ雙染細胞凋亡檢測試劑盒操作,在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。 位于右下象限的早期凋亡細胞和位于右上象限的晚期凋亡細胞之和記錄為凋亡細胞。

9.統計學方法：使用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析與繪圖;兩組比較采用t檢驗;多組采用多因素方差分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.HDAC6 在小鼠腎缺血再灌注損傷后高表達：如圖1 中A、B 所示,與假手術組比較,缺血再灌注組的血清肌酐、尿素氮顯著升高。 與正常組比較,缺血再灌注組的腎臟組織病理學改變包括近端小管細胞壞死和脫落、刷狀邊緣消失、細胞碎片積累、腎小管擴張和蛋白管型形成(圖1C)。 通過RT-qPCR 法和Western blot 法檢測HDAC6 的表達水平。 結果顯示,與假手術組比較,缺血再灌注組中HDAC6 蛋白(圖1D)和HDAC6mRNA(圖1E)表達均顯著升高(P＜0.05)。

圖1 HDAC6 在缺血再灌注組呈高表達(n =6)

2.TA 可以減輕缺氧復氧導致的細胞損傷,增加細胞活力：用CCK-8 檢測正常+ DMSO 組、正常+TA 組、缺氧復氧+ DMSO 組、缺氧復氧+ TA 組增殖情況,結果顯示,缺氧復氧組相對正常組吸光度值降低,表示細胞增殖活力降低;而缺氧復氧+ TA 組,吸光度值相對于缺氧復氧+DMSO 組增高,表示細胞增殖活力增強(圖2A)。 利用流式細胞術檢測凋亡,結果顯示, 缺氧復氧組相對正常組細胞凋亡增多;而缺氧復氧+ TA 組細胞凋亡減少(圖2 中B、C,P＜0.05)。

圖2 不同組細胞活力及凋亡情況

3.HDAC6 抑制劑促進α-微管蛋白乙酰化：Western blot 法檢測4 組細胞中α-微管蛋白乙酰化表達水平。 結果顯示,與正常組比較,在缺氧復氧組細胞中α-微管蛋白乙酰化表達降低,表明HDAC6表達增加,可以抑制α-微管蛋白乙酰化水平;而缺氧復氧+TA 組,α-微管蛋白乙酰化水平增高,表明HDAC6 抑制劑可促進α-微管蛋白乙酰化(圖3,P＜0.05)。

圖3 各組細胞α-微管蛋白乙酰化表達水平

4.HDAC6 抑制劑增強自噬：通過Western blot 法檢測4 組細胞中自噬相關蛋白表達水平。 結果顯示,與正常組比較,在缺氧復氧組細胞中自噬相關蛋白LC3、Beclin-1、ATG7 表達增加,表明在缺氧復氧時細胞自噬激活;而缺氧復氧并加入抑制劑TA 組,自噬相關蛋白LC3、Beclin-1、ATG7 表達水平相對于單純缺氧復氧組增強,表明HDAC6 抑制劑可增強自噬(P＜0.05,圖4)。

圖4 不同組織細胞自噬相關蛋白表達水平

討 論

HDAC6 是Ⅱb 類組蛋白去乙酰酶,調節許多重要的生物過程,HDAC6 的異常表達也與各種疾病的發展有關,例如癌癥、神經退行性疾病、炎癥性疾病以及腎臟疾病[19～21]。 有研究指出,HDAC6 與組蛋白和非組蛋白底物相互作用,參與基因轉錄、DNA 損傷修復和細胞運動。 HDAC6 的表達增加或活性增強,導致致癌細胞的轉化和腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和有絲分裂。 使用HDAC6 抑制劑可用抑制腫瘤的發展。 另有研究認為,HDAC6 抑制劑能保護和營養神經細胞,誘導神經元細胞分化,對多種神經退行性疾病都有潛在治療效果[19]。

有研究表明,選擇性HDAC6 抑制劑可以抑制炎癥信號通路和減輕內毒素誘導的急性肺炎[20]。 Shi等[21]研究顯示,在甘油注射誘導橫紋肌溶解小鼠中,HDAC6 表達增加,使用HDAC6 選擇性抑制劑TA 可顯著降低血清肌酐和血尿素氮水平,減輕腎小管損傷,表明HDAC6 可能促進橫紋肌溶解誘導的AKI,而HDAC6 抑制劑對AKI 具有治療潛力。 本研究通過Western blot 法和RT-qPCR 法檢測發現,在缺血再灌注組小鼠腎臟中HDAC6 表達增加。 通過CCK-8及流式細胞術可以發現缺氧復氧組細胞活力降低及凋亡增加,而使用HDAC6 抑制劑可以增加細胞活力減少細胞凋亡。 α-微管蛋白是細胞分裂、形成、運動和細胞內轉運所必需的蛋白。 α-微管蛋白乙酰化水平與疾病密切相關。 在Zhang 等[22]研究中,證明了HDAC6 抑制劑能增加α-微管蛋白乙酰化水平,減輕腦缺血再灌注損傷。 Western blot 法檢測發現,在缺氧復氧組α-微管蛋白乙酰化水平降低,而使用HDAC6 抑制劑可以增加α-微管蛋白乙酰化水平。

腎臟細胞的基礎自噬對于維持腎臟穩態、結構和功能至關重要。 自噬失調能促進急性腎損傷和急性腎損傷后腎臟不完全修復,以及各種各樣的慢性腎臟疾病,包括糖尿病腎病、局灶節段性腎小球硬化癥和多囊性腎病變[23～25]。 有研究提出,自噬受損,增加腎細胞對糖尿病相關損傷的易感性,會促進糖尿病的進展[25]。 本研究發現,缺氧復氧誘導了腎小管上皮細胞自噬,增加了LC3、Beclin-1、ATG7 表達。 使用HDAC6 選擇性抑制劑TA,可進一步增強缺氧復氧組細胞LC3、Beclin-1、ATG7 表達,這表明抑制HDAC6可增強自噬,促進腎小管細胞存活。 α-微管蛋白參與了自噬體的形成、自噬體在細胞質中的運輸以及自溶體的形成。 有研究報道,HDAC6 可抑制α-微管蛋白乙酰化水平,影響自噬形成,導致心肌損傷[26]。因此在缺血再灌注損傷中,阻斷HDAC6,減輕腎功能損傷可能與增加α-微管蛋白乙酰化水平、增強自噬有關。

綜上所述,本研究發現,在缺血再灌注損傷的腎臟組織和缺氧復氧的腎小管上皮細胞中HDAC6表達上調,使用抑制HDAC6 選擇性抑制劑TA,可促進缺氧復氧細胞中α-微管蛋白乙酰化和自噬相關蛋白表達,減少細胞損傷。 因此,HDAC6 抑制劑可能具有治療腎臟缺血再灌注損傷的潛在臨床意義。