氧化苦參堿靶向EGFR抑制膠質母細胞瘤細胞谷氨酰胺代謝

陳 立 王 承 郝必烈

膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人中最常見和最具侵襲性的原發性腦腫瘤,惡性GBM 患者的預后極差,5年生存率低于5%[1]。 因此,理解GBM 的分子基礎和發生過程對于有效治療GBM 具有重要意義。 目前,腫瘤能量代謝異常已逐漸成為腫瘤學研究的熱點之一。 除了葡萄糖和Warburg 效應之外,谷氨酰胺(glutamine)代謝上調也成為多種腫瘤的特征之一[2]。 谷氨酰胺是腫瘤生長所必需的氨基酸,腫瘤細胞需要異常的谷氨酰胺代謝來促進其生長、增殖和存活。 有研究顯示,抑制谷氨酰胺代謝可以顯著抑制膠質瘤細胞的生長、遷移和侵襲能力[3]。此外,有研究發現,谷氨酰胺代謝在GBM 中發揮著重要的調節作用[4]。 氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)作為苦參的主要生物堿提取物之一,具有抗病毒、抗纖維化、抗炎和抗心律失常等多種藥理作用[5]。 近年來研究表明,OMT 對多種類型的腫瘤具有抑制作用[6]。 然而,OMT 對于GBM 的作用目前還鮮有研究報道。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的遺傳改變發生在約50%的GBM 患者中。 有研究發現,EGFR 在包括GBM 在內的膠質瘤的代謝異常中發揮關鍵作用。 由于其磷酸酶活性,EGFR 可以激活Ras 和PI3K 以促進Warburg 效應和腦腫瘤發生[7]。 近年來研究發現,EGFR 通過MEK/ERK/ELK1 通路促進GBM 中的谷氨酰胺代謝[8]。 此外,OMT 被發現可以靶向胃癌細胞中EGFR,從而抑制胃癌細胞的增殖和侵襲[9]。 因此,研究OMT 是否可以通過EGFR 調控GBM 中谷氨酰胺代謝水平,可以為臨床上OMT 治療GBM 提供可靠的理論依據,為改善GBM 的代謝異常提供有潛力的治療靶點。

材料與方法

1.細胞株與主要試劑： 人膠質母細胞瘤細胞系U251(TCHu58)、U87(TCHU138)均購自中國科學院細胞庫(上海)。 一抗p-EGFR(#3777)、EGFR(#4267)和GAPDH(#5274)均購自美國Cell Signaling Technology 公司。 CCK-8 試劑盒(CK04-500)購自日本 Dojindo 同仁化學研究所。 EdU 試劑盒(C103103)購自廣州銳博生物有限公司。 α-KG(ab83431)、 GSH/GSSG (ab138881)、 谷氨酰胺(A073)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2.細胞培養： 細胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養基(DMEM)中進行培養,并置于5% CO2、37℃的加濕培養箱中。

3.CCK-8 檢測細胞活力： 將細胞接種至96 孔板(1 × 104個/孔) 中,于37℃下孵育過夜。 經過OMT 和(或)EGF 處理后,加入10μl 試劑,于37℃下孵育4h,通過酶標儀檢測每孔細胞在波長450nm 處的吸光度(A)值,并計算細胞活力(%) = (細胞總數-死細胞數)/細胞總數×100%。

4.EdU 檢測細胞活力： 取對數期生長細胞,接種至96 孔板(1 ×105個/孔)中,于37℃下孵育過夜。經過OMT 和(或)EGF 處理后,按照說明書通過細胞培養基稀釋EdU 試劑,并制備EdU 培養基。 每孔加入100μl 50μmol/L 的EdU 培養基孵育2h,清洗后對細胞固定化,進行染色、觀察。

5.谷氨酰胺代謝標志物檢測： 取2 ×106個細胞在PBS 中勻漿,收集上清液,并通過10kDa Amicon Ultra Centrifugal Filters 去除蛋白質,按照說明書,檢測流通液中α-KG、GSH/GSSG 的水平。 對于谷氨酰胺的檢測,將細胞培養在24 孔板中,于37℃下孵育過夜。 收集培養基,按照說明書檢測谷氨酰胺的消耗水平。

6.蛋白免疫印跡檢測細胞中EGFR 蛋白水平：細胞經過處理后,通過SDS 提取總蛋白,細胞裂解液在4℃下以10000r/min 離心30min。 測定蛋白濃度后,通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質并轉移至PVDF 膜上。 5% 脫脂牛奶封閉1h 后,4℃過夜孵育一抗。 洗滌后,孵育辣根過氧化物酶偶聯的二抗,室溫下孵育2h。 通過增強型化學發光試劑盒檢測待測物表達情況。

7.統計學方法： 應用Graphpad 8.0 統計學軟件對數據進行統計分析,計量數據以均數± 標準差(±s)表示,每個處理重復3 次,多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.OMT 抑制GBM 細胞生長：為了研究OMT 在GBM 腫瘤進展中的潛在作用,本研究選用了U87 和U251 兩種GBM 細胞系。 通過CCK-8 檢測不同濃度的OMT 處理12、24、48h 時的細胞活力(圖1A)。對于兩種細胞系,當OMT 為2mg/ml 時,在48h 后細胞活力相當于未處理細胞的50%。 結合EdU 檢測結果(圖1B)均表明,OMT 以劑量依賴性方式有效抑制GBM 細胞的生長。

圖1 OMT 抑制GBM 細胞生長

2.OMT 抑制GBM 細胞中谷氨酰胺代謝：本研究評估了OMT 對GBM 細胞谷氨酰胺代謝的作用。 通過2mg/ml 的OMT 處理GBM 細胞48h,測定了谷氨酰胺重要代謝物α-KG 的水平,結果顯示,在OMT處理的細胞中α-KG 水平顯著下降(圖2A)。 此外,谷氨酰胺的副產物GSH/GSSG 在OMT 處理后也被抑制(圖2B),谷氨酰胺消耗(谷氨酰胺向谷氨酸的轉化)也下降(圖2C)。 綜上所述,OMT 會抑制GBM細胞中谷氨酰胺代謝。

圖2 OMT 抑制GBM 細胞中谷氨酰胺代謝

3.OMT 靶向抑制GBM 細胞中EGFR 的表達水平：為了研究OMT 是否通過EGFR 抑制GBM 細胞的谷氨酰胺代謝,首先測定了OMT 處理后EGFR 的表達情況。 圖3A 顯示,OMT 處理會顯著抑制p-EGFR蛋白表達。 因此,為了研究EGFR 對GBM 細胞的影響,首先通過能夠激活EGFR 通路的配體EGF 來上調GBM 細胞中EGFR 的表達。 結果顯示,通過50ng/ml 的EGF 處理細胞15、30、60min 后,細胞中p-EGFR 表達隨著EGF 刺激時間的增加而升高(圖3B)。

圖3 OMT 靶向抑制GBM 細胞中EGFR 的表達水平

4.EGFR 促進GBM 細胞中谷氨酰胺代謝：分別在EGF 處理細胞15、30、60min 后,測定谷氨酰胺代謝標志物的水平。 試劑盒檢測結果顯示,兩種GBM細胞系種,谷氨酰胺重要代謝物α-KG、谷氨酰胺的副產物GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗水平均隨著刺激時間增加而升高(圖4)。 這些結果說明,EGF 激活的EGFR 會促進GBM 細胞中谷氨酰胺代謝水平。

圖4 EGFR 促進GBM 細胞中谷氨酰胺代謝

5.OMT 靶向EGFR 抑制GBM 細胞中谷氨酰胺代謝：為了驗證OMT 是通過EGFR 抑制GBM 細胞中谷氨酰胺代謝,本研究經OMT 處理細胞,并通過EGF 激活EGFR 表達(圖5A),測定細胞中谷氨酰胺代謝標志物的水平。 結果顯示,由OMT 處理抑制的α-KG、GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗的水平,能夠被EGF 激活的EGFR 顯著逆轉(圖5 中B ～D)。OMT 靶向EGFR 抑制GBM 細胞中谷氨酰胺代謝。

圖5 OMT 靶向EGFR 抑制GBM 細胞中谷氨酰胺代謝

討 論

苦參(Sophorae flavescens)是一種傳統的中草藥,是苦參艾的干燥根。 苦參在《神農本草經》中首次被記載,用于炎癥、實體瘤等疾病治療。 苦參主要包括生物堿、黃酮類、烷基氧雜蒽酮、醌類、三萜苷、脂肪酸和精油等化學成分[10]。 其中,氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是苦參的主要生物堿提取物之一,在不同類型的腫瘤中均發揮抑制作用[11]。 OMT 在不同的腫瘤中靶向調控的基因是不同的,其發揮抑癌作用的分子機制也是不同的。 近年來,腫瘤能量代謝的作用受到越來越多的關注。 既往研究發現,OMT 通過調節丙酮酸激酶M2 介導的有氧糖酵解,對結直腸癌細胞轉移發揮抑制作用[12]。 糖酵解是能量代謝中葡萄糖代謝的一種,癌細胞以高速率但低效率的方式消耗大量葡萄糖,以提供ATP 并產生乳酸,這也被稱為Warburg 效應[13]。 然而OMT 是否會參與谷氨酰胺代謝及其明確的分子機制尚不完全明確。 本研究發現,OMT 能夠抑制GBM 細胞的谷氨酰胺代謝過程、抑制細胞生長。

谷氨酰胺被認為是正常生物體中的非必需氨基酸,它對大多數癌細胞的快速增殖和生長至關重要[14]。 腫瘤細胞通過細胞膜上大量的轉運蛋白吸收谷氨酰胺,并在谷氨酰胺酶的催化下將谷氨酰胺轉化為谷氨酸[15]。 谷氨酸可以進入細胞質或線粒體,作為底物,進一步轉化為α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, α-KG),維持三羧酸(tricyclic acid, TCA)循環的穩定運行,產生ATP,為腫瘤細胞提供碳源和氮源作為能量,用于維持細胞氧化還原穩態和脂肪酸合成[16]。 因此,谷氨酰胺代謝被認為腫瘤細胞代謝除Warburg 效應之外的另一大特征。 近年來,越來越多的研究證實,針對谷氨酰胺代謝的治療可以有效抑制多種腫瘤的進展[17]。

EGFR 是一種屬于酪氨酸激酶受體家族的糖蛋白,與各種腫瘤的發生和發展以及腫瘤的入侵和轉移有著千絲萬縷的聯系[18,19]。 EGFR 的激活與細胞增殖、侵襲和GBM 復發顯著相關[20]。 此外,EGFR 在GBM 的代謝異常中起重要作用。 EGFR 誘導的Max選擇性剪接促進膠質瘤中的葡萄糖代謝和腫瘤生長,抑制EGFR 驅動的糖酵解誘導GBM 細胞凋亡[21]。此外,非小細胞肺癌中,EGFR 突變會引起谷氨酰胺酶的表達水平升高[22]。 本研究發現,EGFR 能夠促進GBM 細胞中重要代謝物α-KG、谷氨酰胺的副產物GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗增多,促進谷氨酰胺代謝。并且OMT 會抑制GBM 細胞中EGFR 的表達來發揮谷氨酰胺代謝的抑制作用。

綜上所述,對GBM 細胞進行OMT 治療,能夠顯著抑制GBM 細胞生長及谷氨酰胺代謝,而OMT 可能通過抑制EGFR 的表達水平發揮上述作用。 本研究結果有助于發現治療GBM 的新型低分子化合物,并為闡明新的藥效靶點提供一定的藥理學基礎。