基于功能宏基因組學挖掘抗生素耐藥基因研究進展

魯兆祥 王夕冉 連新磊 廖曉萍 劉雅紅 孫堅

（1. 華南農業大學獸醫學院,廣州 510000；2. 國家獸醫微生物耐藥性風險評估實驗室,廣州 510000；3. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室,廣州 510000）

抗生素被廣泛的應用于臨床治療、疾病預防以及農業生產等諸多領域。抗生素的大量使用甚至一定程度上的濫用使得細菌耐藥性問題逐漸成為威脅公共衛生與食品安全的一大難題。受制于微生物的培養，基于耐藥細菌培養鑒定的傳統耐藥性研究方式無法獲得綜合全面的信息。而功能宏基因組學方法不依賴于對特定細菌的培養，并且將表型篩選與高通量測序有機結合，方便獲得基于耐藥表型的大量數據，因此在發掘新型耐藥基因的應用上發揮了巨大的作用，展現了良好的發展潛力。但是功能基因組的發展依然存在大片段文庫的構建方法和宿主外源表達的問題，隨著以上問題的解決，功能宏基因組學將會在發掘新型耐藥基因中發揮更大的作用。

1 抗生素耐藥性問題

近年來隨著抗生素的大量使用，不斷發展的抗生素耐藥性問題已經成為全球公共衛生面臨的嚴峻威脅，現有的抗生素治療方案已難以應對由耐藥細菌引起的復雜感染。有文獻報道，2014年全球有接近70萬人死于由耐藥細菌引起的感染，如果這一問題繼續發展，30年后可能有超過1 000萬人因此喪命［1］。目前新型抗生素的研發遇到瓶頸，新型藥物研發耗時漫長，花費過高，致使在臨床上治療多重耐藥細菌感染的有效藥物不斷減少［2-3］。

隨著研究的深入，人們逐漸意識到細菌耐藥性的產生是人類、動物和環境等多方面因素共同作用的結果，也同樣影響著人類、動物和環境［4］。雖然抗生素耐藥性最初被認為是人類健康問題，但由于當前的全球經濟政策，人類、動物和環境越來越相互滲透，生態系統與人類活動互相影響，暗示著抗生素耐藥性可能在生態系統中協同進化互相作用［5］。

已有多個研究表明，多種人類致病菌中的耐藥基因，與環境中細菌的耐藥基因具有高度相似的核苷酸序列［6］，因此耐藥基因可能通過水平轉移，轉入臨床致病菌中，并進一步在新的宿主環境中發生轉移與進化，造成了潛在的安全隱患。這一發現強調了對環境中大量未知抗生素耐藥基因進行挖掘的必要性，不僅能夠豐富人們對于更為復雜生態細菌中潛在耐藥威脅的認知，深化理解細菌與環境的相互作用，而且還有助于人們提前防范未來超級細菌的產生。

1.1 各類抗生素的臨床應用及耐藥現狀

近年來，各種新型耐藥基因不斷涌現，針對各類抗生素的耐藥形勢也越來越嚴峻。目前被廣泛使用的抗生素在臨床應用中均出現了明顯的耐藥情況。遏制細菌耐藥性危機已經成為全人類生存發展亟待解決的問題。

β-內酰胺類抗生素是第一類被發現的抗生素，也是臨床中最常用的抗生素之一［7］。β-內酰胺類抗生素是治療革蘭氏陰性菌感染的一線藥物［8］，由于其在畜牧養殖與臨床診療中被廣泛應用，使這類抗生素的耐藥性持續增加［9］。之前的研究表明，從美國和歐洲的59個醫療中心的肺炎患者上分離得到的大腸桿菌對頭孢曲松、頭孢他啶、美羅培南等β-內酰胺類抗生素展現了較高的耐藥率（表1）［10］。在中國，β-內酰胺類抗生素的耐藥現狀也十分嚴重，例如上海療養院分離得到的大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素廣泛耐藥，其中氨芐西林的耐藥率高達97.5%（表 1）［11］。

四環素是廣譜抗生素，廣泛用于對抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌。由于四環素類藥物具有廣泛適用、成本低等諸多優點，近年來此類抗生素在動物和人類感染治療中的應用不斷增加［12-13］。這導致了耐四環素細菌的出現，現在開始逐漸限制此類抗生素的使用［14］。例如在中國四川省的肉雞屠宰過程中，四環素類藥物的耐藥菌檢出率就高達51.9%［15］。而對四川某醫院的患者送樣標本中的菌株分離鑒定發現，其對四環素類藥物的耐藥率大于70%［16］。

氨基糖苷類抗生素廣泛用于醫學［17-18］和農業領域［19-20］，是最古老的抗菌藥物類別之一。氨基糖苷類抗生素是殺菌抗菌劑，通過與 30S 核糖體亞基結合，損害細菌蛋白質合成而發揮作用。2013-2014年上海市的醫院重癥監護室臨床病例標本分離的鮑曼不動桿菌對慶大霉素、頭孢菌素、氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率在96%以上。環境標本分離的鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物阿米卡星耐藥率最高，達62.39%［21］。其他類抗生素如大環內酯類、林可酰胺類等均表現出了顯著的耐藥情況（表1）。因此，進一步對臨床細菌進行耐藥性監測與發掘工作成為后續指導合理用藥及遏制耐藥性發生發展的關鍵任務［22］。

表1 臨床抗生素耐藥情況Table 1 Overview of antibiotic resistance in clinical isolates

1.2 耐藥基因的檢測及新型耐藥基因的發掘

目前在實驗室水平對細菌耐藥基因檢測主要依賴于兩種傳統的方法。一是基于可培養細菌中耐藥基因的識別方法，作為鑒定抗生素耐藥頻率的常規方法，這是鑒定耐藥細菌的“黃金標準”［23］。但是這類方法往往受制于所研究細菌的可培養性。例如土壤中也存在大量抗生素耐藥基因，但土壤中可培養的細菌只占非常小的部分，因此基于可培養細菌的方法無法全面表征在不可培養的土壤微生物中的抗生素耐藥基因［24］。二是使用有針對性的PCR的方法［25］識別和量化已知序列的抗生素耐藥基因也因其準確性與可操作性被普遍用于耐藥細菌的檢測。但是這些技術要求我們已經獲得耐藥基因的相關信息，因此只能用于檢測先前報道過的基因［26-27］。在過去的十年間，基于高通量測序技術的宏基因組學研究極大地拓展了我們的微生物學認知［28］。從單一菌株到微生物群落，從可培養微生物到不可培養微生物，使細菌耐藥基因探索領域發生了革命性的變化。基于宏基因組學的方法，能夠對所獲得樣本中的微生物群落的總DNA直接進行測序，無需培養，使宏基因組學技術手段被廣泛地應用到探索環境中未知抗生素耐藥性基因研究中［29-30］。使用這項技術，可以對種群中所有微生物的 DNA 進行整體分析，不僅可以做到揭示微生物物種信息，還可以深入了解微生物種群中可能存在的各種抗性因子。但是對微生物宏基因組進行測序，難以識別與已知耐藥基因具有極低核苷酸相似性的耐藥基因，同時低拷貝數的耐藥基因也常常被忽略。此外，其最大的局限性在于無法確認假定的耐藥基因的功能，因此需要進行額外的補充實驗以闡明其功能。因此，在宏基因組學的基礎上，結合表型篩選，功能宏基因組學被創立并發展成為鑒定新型耐藥基因的有力工具，也是研究抗生素耐藥機制及其相關基因的最有效和最強大的方法之一。

2 功能宏基因組學及其在耐藥基因研究中的應用

2.1 功能宏基因組學的一般方法

如上所述，功能宏基因組學是近年來發展起來的一種用于鑒定抗生素耐藥組（antibiotic resistome）的有效手段［31］，此方法基于樣品中的基因組，通過對樣品宏基因組進行物理或生物手段剪切成功能性小片段。進一步的，將這些片段連接到表達載體中并轉化到易感受體菌株中，從而得到功能宏基因組文庫。針對獲得的功能宏基因組文庫，首先利用藥理、生化和分析化學技術對文庫進行功能或表型的篩選，以獲得在特定環境下表達優勢或功能優勢的目的克隆，并進一步使用高通量技術建立起表型與基因型之間的聯系，基本流程如圖1所示。

圖1 功能宏基因組學方法的基本流程Fig. 1 Basic flow of functional metagenomics approach

由于抗性通常是可轉移的，而水平基因轉移是以前易感菌株獲得抗性的最常見的方法。環境細菌擁有的抗性基因可能被人類病原體所獲得，進而對人類健康產生威脅。針對上述問題，功能宏基因組學通過兩個方面來開展研究：一是發現新型抗生素和抗感染藥物；二是鑒定微生物種群中的抗性基因。相較于傳統方法，功能宏基因組主要有以下優點：（1）不需要培養微生物；（2）不需要事先對耐藥基因（antibiotic resistance gene，ARG）序列進行研究；（3）有耐藥表型的克隆和測序得到的ARGs直接相關［32］。因此，功能宏基因組學技術成為揭示新型抗生素耐藥基因并識別其功能的關鍵手段，為研究抗生素耐藥基因的傳播機制和作用方式拓寬了道路。

2.2 功能宏基因組學在微生物領域的應用

自創立以來，功能宏基因組方法已被運用于多種環境中識別許多新的基因，比如在發現編碼碳水化合物酶基因過程中，利用功能宏基因組學將UDP-葡萄糖-4-差向異構酶鑒定為甲萘醌的抗性蛋白，加速了抗性功能新基因的發掘［33］。到目前為止，人體腸道微生物組中僅有約20% 的細菌物種被成功培養［24］。得益于基因組和宏基因組序列的大規模分析應用,大量與人類腸道微生物組中主要功能相關的蛋白質家族基因被挖掘出來［34-39］。例如在已有報道中，利用功能宏基因組方法從腸道細菌中成功鑒定出大量β-D-葡萄糖醛酸酶，擴大了已知的具有葡萄糖醛酸酶活性功能的酶的數量，同時也突出了腸道微生物組內葡萄糖醛酸酶多樣性［40］。借助宏基因組學方法對復雜微生物群落的獨特鑒別優勢，Culligan等利用功能宏基因組學方法對人類腸道菌群中耐鹽基因進行了篩選，研究結果有助于我們研究人類腸道菌群對滲透壓的抵抗能力［41-44］。還有報道對工業甘蔗廢渣進行采樣并建庫，發掘出新的編碼糖基水解酶的基因［45］，這證明了未培養微生物作為重要生物資源的巨大潛力。此外，依托于功能基因組技術的發展，編碼氫化酶的基因［46］以及編碼細菌磷酸酶的基因［47］也得到了發掘。由此可見，功能宏基因組在基于特定功能或表型上的新型基因發掘具有顯著優勢與應用價值，大量相關研究也為后續服務于耐藥基因發掘與表征奠定了理論與實踐基礎。

2.3 功能宏基因組學在發掘耐藥基因方面的應用

功能宏基因組學方法具有靶向特定表型進行特異性測序分析的優勢，因此逐漸拓展到研究微生物耐藥基因發掘領域。近年來，利用功能宏基因組學方法，大量新型耐藥基因得以揭示［48-51］。更有報道指出，功能宏基因組能夠對土壤中各類抗性蛋白進行高效篩選,這極大地豐富了在抗菌過程中各種抗性蛋白的發掘［52］。除了抗性基因本身，功能宏基因組還被用于發掘介導耐藥性傳導的可移動元件，利用其高通量的優勢系統性地分析質粒的宏基因組，拓寬了宏基因組技術在耐藥質粒上的應用［53］。

在一項最近的研究中，Martiny等［48］利用功能宏基因組技術研究海鷗棲息地的耐藥基因多樣性和遺傳背景，并對野生動物中的β-內酰胺酶類耐藥基因進行發掘。結果顯示，共有31個未報道過的新型β-內酰胺酶類耐藥基因被檢出，暗示了多種耐藥基因可能已經在野生動物體內駐留并發生潛在的進化。這項研究也表明了抗生素耐藥性極有可能通過野生動物為媒介在人類主導的棲息地和周圍環境之間進行傳播。此外，還有通過功能宏基因組學闡明土壤微生物群中碳青霉烯酶編碼基因的發生、多樣性和功能的異質性。Gudeta等［49］利用功能宏基因組學方法對土壤樣品中的微生物進行分析，發現了9種不同的金屬-β-內酰胺酶（MBL），能夠快速降解包括碳青霉烯在內的多種β-內酰胺類抗生素。有趣的是，功能宏基因組學產生的 MBL通常與基于土壤中可培養細菌中分離鑒定的MBL不同，表明這兩種方法針對了土壤微生物群中的不同亞群。這意味著功能宏基因組學方法在分離抗生素耐藥基因亞型方面有著獨特的優勢。

在針對四環素耐藥基因發掘方面，功能宏基因組學方法同樣被廣泛應用。Gasparrini等［50］利用功能宏基因組技術首次報道了四環素類失活酶家族tet（X7），加深了學界對四環素降解酶類耐藥基因的認知。此外，還有研究通過對暴露于抗菌劑合成的廢水環境取樣，并構建功能宏基因組文庫，利用多種抗生素對文庫進行篩選，成功鑒定了編碼新型tetA型外排泵的基因以及新型1類整合子攜帶抗生素耐藥基因，該tetA型外排泵被命名為tetA（62）［51］。這項研究通過功能宏基因組技術證明了工業廢水的排放影響環境中存在的抗性基因的多樣性和傳播潛力，并為防控四環素耐藥性的生成與傳播提供了理論基礎。

在針對土壤中抗性蛋白探究的過程中，通常存在由于編碼抗性蛋白的基因在整個微生物基因組中的低豐度導致無法精確檢測的問題。因此McGarvey等［52］利用功能宏基因組技術表征土壤中可能存在的抗性蛋白，通過表型篩選富集并揭示了幾個抗生素抗性蛋白家族中天然存在的變異，具體包括ADP-核糖基轉移酶、二氫葉酸還原酶、氨基糖苷類乙酰轉移酶和轉運蛋白。這些功能基因能夠協助微生物獲得針對特定抗菌藥物的抗性。此研究的開展增加了學界對環境細菌中抗性決定因素的認識，展示了編碼抗性決定因素基因序列的多樣性，有助于對這些抗性蛋白進一步的探究。

除了細菌中可能存在的新型耐藥基因，功能宏基因組還可以對固定生態位中的多種微生物群落進行耐藥基因發掘。Moon等［54］對漢江水體中的病毒微生物組進行研究，通過功能宏基因組學手段建立文庫對病毒組中的潛在耐藥基因進行廣泛篩查，發現了多種β-內酰胺酶、多藥轉運蛋白、多黏菌素抗性蛋白和萬古霉素抗性蛋白基因，其中β-內酰胺酶甚至可以催化特定碳青霉烯類藥物的降解。由于水體環境中存在較高的噬菌體豐度，這些病毒組中存在的耐藥蛋白可能是由整合在噬菌體中的功能性基因編碼。在淡水病毒組中發現這些新的抗性基因表明環境噬菌體可能是被長期忽視的耐藥基因的重要儲庫。

如上文所述，功能宏基因組技術還可被用于針對菌群中新型質粒的鑒定，深入挖掘可介導耐藥性傳導的可移動元件。Zhang等［53］利用污水處理廠附近耐藥基因高度富集這一特點，對所采的污泥樣品進行質粒宏基因組分析并發現編碼四環素（27.2%）、大環內酯（25.0%）和多藥（24.9%）耐藥性的ARGs在活性污泥中呈現高流行率。并且結合功能宏基因組研究發現這些ARGs可與毒力因子（VFs）一起被可移動遺傳元件（包括質粒、整合子和轉座子）攜帶，形成共轉移的傳播風險，并且這些攜帶耐藥基因的可移動元件還呈現出較高的多樣性和豐度。Marathe等［55］利用功能宏基因組技術，通過表型篩選結合下游的PacBio測序技術，不但篩選得到了幾種新型碳青霉烯酶基因，還憑借PacBio測序深度優勢完整描繪了耐藥基因周圍包括可以移動遺傳元件在內的多種特殊基因環境與質粒類型，拓廣了我們對于攜帶碳青霉烯酶耐藥質粒的認知。

綜上所述,功能宏基因組學因其結合表型篩選與高通量測序的特點，已在耐藥性研究領域展現了巨大潛力并得到廣泛應用,近年來利用功能宏基因組技術發掘或鑒定的耐藥基因詳見表2。

參Reference獻文考［5 6］7］［52］［58］［52］［59］［50］［61］［62］［63］［64］［6［53］［65］RP AE fosB、RP sul1、sul2 macB、B、l2ma A、A、AF Others AF B、P、rosB、A、rosA rn AcRP eE、erm、R P、FR feE m phB Ts AcRP A他eB、smeE、AR smeB、smeE、qnrA、m RecX sm其bacA、sul1、bacA、a cB、bacA、sul1、sul2 lnu A、macB、mefA、rosA、sm Am F、su tH、rB、M、mdexB、ermT、exG、Q、mexA、m mexB、dtF、Rpos、sdeY dtF、ermG e screening mexW、m ef、G、md mexF、m FS、ermfA、m mexF exE、msrA、oprN、ermC、erm adeA、adeB、m exD、mB、exF、ermB、m多Multidrug resistance藥exW exB、crB、acrA、a藥用耐ermT、ermdtO、D tL、m應nce gen m exD、mmd SR X、RN acrB、m bpeF、erm P、ML acrB、erm C、exB、AB tF、m mdacrB、adeA、mexY mexF、m性ics in resista的選篩tetA1）、tetW、tetX因tetA（G）、31）、34）、tetM、tetO、tetP tet40、Gs and associated antibiotics tetA、tetA（tetA（D）、tet（tetG、tetM、tetA（4 tetC、tetL、基tetA、tetC、b、tet33、tetP tetB、tetT、tetV、tet39、39）、在en、otrC、AR tetV、tetX tetXtetS、tetW、tetG、tet36、抗om tetW 37）、tetX、tetX2、tetY tet34、因類組etag D_ oxa 10 tet32、、STK a、藥環因f m基表plication o tetA（P）、耐 四tet32、Tetracyclines基素tetA（B）、etL、tetA（M）、學tetG、tetH、tetQ、tetS、AL tet33、tet（tetL tetM、tetX tetG、tetO、tetV、tetW、tet39、tet33、tetA、tetC、tetB（P）、tetO、tetP、tetA（P）、tetM、tetO、類其2 宏 及antibioticsAR種B、L1、mecA、OXA、PSE-1、Sed1、TEM-、D M beta-lactam Ap pc、C、ase eta-lactam生類8 am nctional beta-、C素、N（33）、tetA（ase抗胺phClass A酰、B IM-1 β-lactam Table 2 ase T-1、Class A FX-a、laO 21、V Metallo b β-內WA、blaDW 1,2-GD Bifu O bl2D_oxa5、bl2_veb、bl2 lactam bl2D_pse3、ACblaA P S-1、OXA-1、OXA-10、OXA-2、VEB-5 TE BL X A-10、blaVEB-5、blaVEB-3blaC A 2、blaDWA3、blaDWA4、blaDWB1 blaD類苷CF糖CT catB 2、catB3、ceoB、、3、基氨Am inoglycosides RP T、CA E、CF lA、cmx、、floR cmCR D、ceoB、cmlA ceoB、cm l_e3、cm le_8catB tB、cm lA、floRca T、 、S D、FA AT HA H、SD-N TIII、ereA、、MetR、3-N strA T、c、aadA、aadB、3P、AD、PA RP tn、A、G PM aadA、A T、A Adt、aphA-2、strA、PT AT、3 6-NA 2-OXdT ATAT、NL、As GB aadD、a nt2 ia、an t3ia、an t6ia、aph33ib、aph6id、ereA、a aadA、A AAA、aa aa6iia、aac6ib、GR O-DH GR酰Phenicols類H、aphD、ARPA、KNT、GN、A醇3-NA P、2-NA T、T、FA RK、6-N T、T胺T、T、4、AA B、aac6、aadB、HA GA AA 6-NAL、、M EEMTICTL、tR NcAaa strA、strBstrA、strB K+ transport p H、PD A3PH aac、a adA、aa dB、strB源樣Source來品Soil壤土W ater水污Slud泥ge

3 總結與展望

功能宏基因組學方法在新型基因檢測的過程中展現出了巨大的價值和潛力，同時使人們能夠接觸到微生物世界的多樣性，在不可培養的微生物研究方面做出了重大突破。但功能宏基因組學在技術上仍具有一定的局限性，其主要難點在于大片段文庫的構建方法和宿主外源表達的問題［66］。作為功能宏基因組的理想宿主，其應具有支持多種基因外源表達的能力和轉化率高的優點。雖然大多數研究均因易于培養而選擇大腸桿菌，但大腸桿菌在外源基因表達時顯示出了較大的局限性［26］，只有極少數功能宏基因組學研究使用了大腸桿菌以外的宿主［67］。隨著科研工作者的努力，多種用于鑒定具備天然優勢的外源宿主及大型功能宏基因組文庫構建方法被報道，以此來改進功能宏基因組文庫的篩選方法［68］。隨著這些材料和方法的優化也導致了越來越多有意義的化合物被發現。同時，蛋白質組學與功能宏基因組學相結合展現了良好的應用前景，使得每個DNA片段的潛在功能的篩選過程得以簡化［69］。此外，測序技術的進步也極大地幫助了篩選出功能復雜的基因。隨著測序深度的增加，或者長讀數據技術發明（如Nano Pore Minion和PacBio SMRT），都將有助于解決功能宏基因組短讀數據的組裝所帶來的相關問題，同時可以提供基因編碼功能的更多信息，如多藥耐藥基因簇［69］。epicPCR（emulsion, paired isolation and concatenation PCR）也具有良好的應用前景［70］，它與功能基因組學方法相結合后，可以將來自同一個宿主的兩個基因連接成一個擴增子，再對擴增子進行測序。假如其中一個基因是16S rRNA基因，那么就可以對任意一個微生物群落中攜帶功能基因的宿主進行定位。高通量單細胞基因組測序技術可以同時分析多個細胞［71］，這可能有利于功能基因組文庫篩選得到的功能基因進行高通量測序。使 用 MALDI-TOFMS（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）和MBT-ASTRATM的方法可快速檢測單個細菌中的抗生素耐藥水平［72］，這可能將功能宏基因組篩選方法進一步優化。

綜上所述，在細菌耐藥形勢逐漸嚴峻的今天，不斷進化和廣泛流行的耐藥細菌對人類健康和社會經濟構成重大威脅。因此越來越多的研究將焦點逐漸由來源于人類［73-74］和與人類密切相關環境中的耐藥基因［75-76］轉向環境中的土壤和水，甚至是野生動物這些耐藥基因流行傳播的重要環節。功能宏基因組學憑借其高通量、微生物無需培養等優點，在新型耐藥基因的鑒別上展現了巨大的優勢。隨著文庫構建技術的不斷發展優化以及宿主外源表達問題的進一步解決，功能宏基因組學手段將在發掘新型耐藥基因的研究中發揮更大的作用。