同時產碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的豬源大腸埃希氏菌的鑒定及耐藥性研究

李海利 郎利敏 張青嫻 游一 朱文豪 王治方 張立憲 王克領

（河南省農業科學院 畜牧獸醫研究所，鄭州 450002）

產房仔豬腹瀉一直是養豬生產中危害仔豬的一種嚴重的消化道疾病［1］，在集約化規模化豬場、中小規模豬場以及農村散養戶豬場，產房仔豬腹瀉不僅導致仔豬生長緩慢，料報酬低、體型大小不一致，料肉比升高，成為僵豬甚至死亡，而且死亡率高，能達到100%死亡率。這嚴重影響了豬場的經濟效益和運營狀況，給養豬業帶來極大的危害和造成重大的經濟損失。引起產房仔豬腹瀉的原因主要有以下幾個方面：細菌、病毒、寄生蟲、應激、霉菌等因素。其主要原因為大腸桿菌引起的黃白痢和斷奶仔豬腹瀉。

隨著養豬規模的擴大和發展及抗生素的用量增加和濫用，導致細菌耐藥性增強，臨床出現多重耐藥菌株和超級耐藥菌株［2-6］。細菌耐藥機制的產生主要原因是細菌基因在菌體內外、抗性環境及高濃度抗生素環境的壓力下發生變異，使細菌的細胞膜能阻止甚至外排抗菌藥物的進入，使其具有了生成生物膜的能力［7-11］。其中，細菌產生滅活酶或修飾酶是耐藥菌的重要耐藥機制，而β-內酰胺酶是此類酶中數量最多者。到目前為止，細菌產生的β-內酰胺酶已近500種。新德里金屬β-內酰胺酶（NDM）在一印度裔瑞典患者的泌尿道肺炎克雷伯菌分離株中檢測到，2008年第一次被報道，從此，NDM酶迅速傳播并在多個國家的病例中有發現［12-17］。NDM型金屬酶可高效水解多種抗生素，攜帶有該酶的菌株對幾乎所有的抗生素均耐藥，包括碳青霉烯類和β-內酰胺類在內的多類抗菌藥物，所以被稱為“超級細菌”［18-22］。NDM基因主要包括NDM-1-NDM-50的幾十個亞型，其中動物源大腸桿菌上NDM-1和NDM-5基因的流行率呈遞增趨勢［23-27］，幾乎突破了臨床抗感染治療的最后一道防線［28-32］。因此，研發新型藥物、替抗藥物或者尋找一種有效的抗生素替代療法成為擺在全球科研工作者面前的重要科學問題。

本研究從產房仔豬腹瀉病例中分離到1株同時產碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的大腸埃希菌，該菌株對臨床常用的β-內酰胺類和碳青霉烯類抗生素全部耐藥。但是，對磺胺甲惡唑、頭孢美唑、大觀霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南敏感。通過高通量測序和生物信息學分析技術，對HN2106菌株的基因組特征、耐藥質粒特征進行了分析，以期為由超級耐藥細菌引起的產房仔豬腹瀉的防治提供科學參考并為耐藥菌的控制及新藥研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本實驗室留存（2021年1-12月）從河南省及周邊地區豬場產房仔豬腹瀉病例中分離鑒定的亞胺培南敏感性減低的87株大腸桿菌，經過PCR檢測和測序確定其攜帶NDM基因，篩選出一株同時攜帶NDM-1和NDM-5的大腸桿菌，命名為HN2106，以HN2106作為實驗菌株，-80℃保存備用。

1.1.2 試劑與器材 美羅培南和亞胺培南購自上海源葉生物科技有限公司；青霉素G、氨芐西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢噻呋、頭孢比肟、頭孢喹肟等藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發有限公司，引物合成和分子實驗所需試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 耐藥基因篩查 根據文獻查閱碳青霉烯酶耐藥基因［33-34］，基因引物信息見表1。

表1 NDM-5 耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequence of NDM-5-resistant gene

1.2.2 藥敏試驗 采用藥敏紙片法進行耐藥表型測定。判定標準采用中華人民共和國衛生部醫政司（紙片法抗菌藥物敏感試驗標準：WS/T125-1999）。

1.2.3 基因組測序及分析 采用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio的測序方式，對HN2106進行全基因組測序和生物信息學分析。應用BLAST和MEGA軟件對序列進行生物信息學分析、系統進化樹分析和NDM-1及其亞型鑒定。

2 結果

2.1 大腸埃希氏菌HN2106的藥物敏感性

對臨床常用的β-內酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素進行了藥物敏感性試驗，藥敏結果如表2所示。該菌株對臨床常用的β-內酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素全部耐藥，對磺胺甲惡唑、頭孢美唑、大觀霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南敏感。

表2 藥敏試驗結果Table 2 Results of drug susceptibility testing

2.2 大腸埃希氏菌HN2106的基因組特征

Circos基因組圈圖可以全面展示基因組的特征，通過Circos軟件繪制單個樣本基因組圈圖（圖1）。大腸埃希氏菌HN2106的基因組圖包含5 179 971 bp，其G+C含量為50.59%。利用PlasFlow（https：//github.com/smaegol/PlasFlow）軟件對細菌基因組組裝結果進行質粒的鑒定，獲得的質粒序列利用 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 和PLSDB 數 據 庫（https：//ccb-microbe.cs.uni-saarland.de/plsdb/）進行質粒注釋。經分析顯示，HN2106中含有7個質粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmi D 和 plasmid G），3種類型，分別為Col、IncFII、IncQ1。

圖1 HN2106基因組圈圖Fig. 1 Genome circle diagram of E. coli HN2106

2.3 pNDM5-HN2106質粒分析

pNDM5-HN2106（plasmid B） 長 度 為 74 815 bp，其G+C含量為50.24%（圖2）。通過分析顯示，該質粒含有1個耐藥基因blaNDM-5，該質粒類型 為 IncQ1。 通 過 將 pNDM5-HN2106（plasmid B）全序列和GenBank數據庫進行BLAST比對分析發現，該質粒和最近報道的1個質粒pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1）匹配（99.76%的相似性和覆蓋率，該質粒來源于肺炎克雷伯菌）。該質粒和另一個質粒NDM1 plasmid unnamed 2（Accession No CP083890.1）也有很高的相似性（99.08%的相似性和覆蓋率，該質粒來源于1株大腸埃希氏菌）。為了進一步驗證pNDM5-HN21（plasmid B）的基因型，用MEGA軟件對35個NDM基因質粒進行系統進化樹分型，分型結果顯示，與pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1）親緣關系最近，聚入同一分支，為NDM5型。

圖2 Plasmid B圈圖Fig. 2 Plasmid B circle

2.4 pNDM1-HN2106（plasmid C）質粒分析

pNDM1-HN2106（plasmid C） 長 度 為 35 423 bp，其G+C含量為53.44%（圖3）。該質粒含有1個耐藥基因blaNDM-1，質粒類型為IncFII。通過將pNDM1-HN2106（plasmid C）全序列和GenBank數據庫進行BLAST比對分析發現，該質粒和最近報道的1個質粒p1108-NDM（Accession No MG825381.1）匹配（99.98%的相似性和覆蓋率，該質粒來源于1株大腸埃希氏菌）。此外，該質粒和其他一些質粒也有很高的相似性，例如p8C57-NDM（Accession No MT407546.1）、pNDM33-3（AccessionNo CP076650.1）等。為了進一步確定pNDM-HN21（plasmid C）的基因型，用MEGA軟件對55個NDM基因質粒進行系統進化樹分型，分型結果顯示，pNDM-HN2106（Plasmid C）的基因型與p1108-NDM（Accession No MG825381.1，該質粒來源于大腸埃希氏菌，99.98%的相似性和覆蓋率）和p8C57-NDM（Accession No MT407546.1，95%的覆蓋率和99.98%的序列相似性，該質粒來源于大腸埃希氏菌）親緣關系最近，聚入同一分支，為NDM1型。

圖3 Plasmid C圈圖Fig. 3 Plasmid C circle diagram

2.5 大腸埃希氏菌HN2106耐藥基因

經綜合的抗生素抗性基因數據庫（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）分析顯示，HN2106含有21種類型的抗生素耐藥基因（圖4），包括大環內脂類、四環素類、氟喹諾酮類、青霉烷類、頭孢菌素類、苯丙醇類、頭霉素類、氨基糖苷類、肽類、碳青霉烯類、氨基香豆素類、單胺菌素類、青酶烯類、利福霉素類、甘氨酰環素類、吖啶染料類、糖肽類、林可酰胺類、三氯生類、硝基咪唑類、其他類（截短側耳素類、鏈霉殺陽菌素類、核苷類、磺胺類、二氨基嘧啶類、磷霉素類、惡唑烷酮類、硝基呋喃類、莫匹羅星類、砜類、雙環霉素類、游離脂肪酸類、氯化苯甲烴銨類、若丹明類）。具體耐藥基因見附件1。

圖4 21種類型的抗生素耐藥基因Fig. 4 21 types of antibiotic resistance genes

3 討論

隨著碳青霉烯類和β-內酰胺類抗生素的廣泛應用或不規范應用，使大腸桿菌對碳青霉烯類和β-內酰胺酶抗生素產生了耐藥性，尤其是攜帶NDM基因的大腸桿菌的出現［35-38］。碳青酶烯類耐藥腸桿菌（carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE）和多重耐藥菌已成為臨床防控的嚴峻挑戰［39］。NDM耐藥菌對幾乎所有的β-內酰胺類藥物耐藥，對動物疾病治療、公共衛生和食品安全提出了嚴峻挑戰和造成了極大威脅［40-43］。NDM-1“超級細菌”是指許多種（NDM1-NDM50）擁有新德里金屬β-內酰胺酶-1（new delhi-metallo-1，NDM-1）基因的細菌的統稱，攜帶該基因的耐藥菌被稱為“超級細菌”［44-48］。目前，已檢測到產NDM-1基因的主要細菌包括摩氏摩根菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等［49-53］。因此，開展NDM流行病學調查對臨床感染的防控和新藥物研發具有重要意義。本研究從產房仔豬腹瀉病例中分離出1株碳青霉烯酶耐藥基因，經16S rRNA基因測序、NDM耐藥基因擴增以及基因組測序分析，均表明該菌株為大腸埃希菌。藥敏試驗顯示，該菌株除對碳青霉烯類抗生素亞胺培南耐藥外，還對檢測的其他類型抗菌藥物如β-內酰胺類抗生素耐藥，表明該菌株為多重耐藥菌。再結合PCR檢測及全基因組測序分析，表明該菌株是一株產NDM-5和NDM-1的雙重質粒的多重耐藥大腸埃希菌。

HN21含有21種類型的抗生素耐藥基因。進一步分析發現，blaNDM-5位于質粒pNDM5-HN2106（plasmid B）上，blaNDM-1位于質粒pNDM1-HN2106（plasmid C）上。以上結果表明，NDM耐藥基因主要位于質粒上，借助質粒的可傳遞性，并通過質粒復制、接合、轉化及轉座子移位，NDM耐藥基因便很容易地傳播給其他細菌，引起更大范圍的暴發流行和更廣泛的耐藥。

序列比對發現，blaNDM-5攜帶質粒pNDM5-HN2106（plasmid B）和國內所報道的1個質粒pKPNDM-5（Accession No CP084746.1）在序列上有高度的一致性（99.76%的相似性和覆蓋率），該質粒來源于浙江金華醫院分離的肺炎克雷伯菌。該質粒和另一個質粒NDM1 plasmid unnamed2（Accession No CP083890.1）也有很高的相似性（99.08%的相似性和覆蓋率），該質粒來源于澳大利亞1株大腸埃希氏菌。通過基因進化樹分析發現，pNDM5-HN2106（plasmid B）的基因型與pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1，99.76%的相似性和覆蓋率，該質粒來源于肺炎克雷伯菌）親緣關系最近，聚入同一分支。因此，確定pNDM5-HN2106（plasmid B）為NDM5型。以上研究表明，pNDM5-HN2106（plasmid B）類似質粒具有世界流行性的特點，同時該類型質粒對blaNDM-5耐藥基因的傳播發揮著重要作用。該質粒可在不同種屬之間傳播，分離自不同的細菌，包括肺炎克雷伯菌和大腸桿菌。表明該類型質粒可以跨越種屬限制而自由傳播，同時還發現這種類型質粒可以分離自不同的樣本，包括人和動物，進一步說明了該類型質粒傳播的廣泛性。

pNDM-1-HN2106（plasmid C）是本研究發現的另外一個含有NDM基因的質粒，通過序列比對和分析發現，blaNDM-1攜帶質粒pNDM1-HN2106（plasmid C） 和 國 內 報 道 的 p1108-NDM，（Accession No MG825381.1，99.98%的相似性和覆蓋率，該質粒來源于1株從食品中分離到的大腸埃希氏菌）、p8C57-NDM（Accession No MT407546.1，95%的覆蓋率和99.98%的序列相似性，該質粒來源于大腸埃希氏菌）匹配。為了進一步確定pNDM1-HN2106（plasmid C）的基因型，對55個NDM基因進行系統進化樹分型，確定pNDM1-HN2106（plasmid C）的基因型為NDM-1型。以上研究表明，pNDM1-HN2106（Plasmid C）質粒可以在食品和動物之間相互傳播，這已說明了食品、動物和人相互傳播的廣泛性。

本研究鑒定的HN2106為多重耐藥大腸埃希菌，經全基因組測序，HN21中含有7個質粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmid F和plasmid G），Col、IncFII、IncQ1三種類型。主要攜帶兩種耐藥質粒pNDM5-HN2106（plasmid B）和pNDM1-HN2106（plasmid C），分別介導blaNDM-5和blaNDM-1耐藥基因，為耐藥菌進行傳播和擴散形成了基礎。blaNDM-1耐藥基因的共存與傳播給動物和人類及食品安全造成隱患和威脅，有必要加大對動物領域的流行病學調查，為臨床防控提供參考。該研究為此類菌株的潛在傳播機制提供了依據，說明了臨床用藥的合理以及對此類菌株進行監控的重要性。

4 結論

通過對HN2106菌株碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的耐藥基因擴增、測序及全基因組測序分析，證實了HN2106菌株攜帶NDM-1和NDM-5的耐藥基因，其中blaNDM-1位于質粒pNDM-HN2106（Plasmid C）上，blaNDM-5位于質粒pNDM5-HN2106（Plasmid B）上，分別介導blaNDM-1和blaNDM-5耐藥基因，是耐藥菌傳播的重要載體。全基因組耐藥基因預測結果顯示其同時還攜帶21種類型的抗生素耐藥基因。

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