雪蓮SikCDPK1啟動子的克隆和活性分析

史光珍 王兆曄 孫琦 朱新霞

（石河子大學生命科學學院 綠洲城鎮與山盆系統生態兵團重點實驗室，石河子 832003）

新疆天山雪蓮（Sasussured involucrata Kar.et Kir）能夠在常年積雪不化、空氣稀薄、紫外線輻射強烈的高山、懸崖峭壁的石縫中生長，是一種優良的耐極端氣候植物［1］，研究與其相關的逆境基因，對提高植物抗逆性意義重大。

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs）是鈣信號轉導途徑中的主要感受器和效應器，在環境刺激、植物生長發育和激素信號傳遞等過程起重要作用［2］。啟動子是一種具有調節基因功能的順式作用因子，位于結構基因上游，能與RNA聚合酶特異性結合，有效地控制轉錄的起始、表達效率、表達時間和表達特異性［3］。分析研究啟動子的核心區域序列、響應元件類型、數量和響應模式，有利于洞察目的基因的功能及其表達調控機制。

本課題組前期克隆了SikCDPK1基因，發現它在干旱、低溫脅迫下轉錄水平增加［4］。但SikCDPK1基因上游啟動子的序列、結構和其響應機制仍未明確。因此本研究擬在此基礎上，對雪蓮SikCDPK1啟動子進行克隆，探究其序列特征和潛在的響應元件，進一步構建含有報告基因GUS的植物表達載體P0∷GUS及5'端缺失的表達載體（P1∷GUS，P2∷GUS，P3∷GUS），通過瞬時轉化煙草、低溫和干旱脅迫、GUS染色來研究SikCDPK1啟動子的活性，為探明 SikCDPK1基因的上游調控序列和進一步解析雪蓮SikCDPK1基因響應脅迫的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雪蓮由本實驗室組培培養，本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種子、大腸桿菌（Eschrichia coli）感受態細胞DH5α、根癌農桿菌GV3101、植物表達載體pCAMBIA1304均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 雪蓮SikCDPK1基因啟動子的克隆和順式作用元件分析 根據本課題組前期克隆的SikCDPK1基因序列，分別設計了3條嵌套的特異性引物SP1、SP2和SP3，同時合成4條具有低Tm值的短的隨機簡并引物AD1-AD4和一條特異性引物AD5（表1），以雪蓮基因組DNA為模板，根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環，通過TAIL-PCR技術分3次反應來擴增SikCDPK1的上游序列。第1輪PCR反應體系為DNA模板1 μL、隨機簡并引物AD1-AD4 各 0.5 μL，引物 SP1 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×Taq PCR mix 10 μL。在第2輪反應中，將第1輪PCR產物稀釋100倍作為第2輪反應的模板，SP1更換為SP2，其余條件不變；在第3輪反應中，將第2輪反應產物稀釋100倍作為模板，SP2更換為SP3，其余條件不變。PCR反應程序參考Liu等［5］的方法。PCR反應結束后，利用1%的瓊脂糖凝膠分別對3輪TAIL-PCR擴增結果進行檢測，選取第3輪結果中符合大小的特異性條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化。然后進行連接，轉化至大腸桿菌。利用pMD-19T載體的通用引物M13F/R進行菌液PCR和測序。獲得啟動子序列后，通過plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子順式作用元件。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 啟動子驅動的GUS植物表達載體的構建 為了深入研究SikCDPK1啟動子的功能，在全長啟動子P0的基礎上，根據順式調控元件設計了3個不同長度的5'端序列缺失的上游引物（帶Hind III和Spe I酶切位點）（表1），并以此為模板，擴增含有不同截短長度的SikCDPK1啟動子片段。同時，用Hind III和Spe I雙酶切植物雙元表達載體pCAMBIA1304，回收目的片段，經同源重組重新連接。重組質粒經菌液PCR和測序驗證后，獲得不同長度的pSikCDPK1∷GUS表達載體，分別命名為P0∷GUS，P1∷GUS，P2∷GUS，P3∷GUS（圖 1）。

圖1 SikCDPK1啟動子驅動的GUS表達載體Fig. 1 GUS expression vectors driven by SikCDPK1 promoters

1.2.3 農桿菌介導的煙草瞬時轉化與GUS酶活測定 將構建好的載體轉化到根癌農桿菌GV3101中，用注射器將菌液注射至煙草葉片，在黑暗條件下保溫、保濕培養24 h之后，恢復正常光照培養24 h。對所有注射過的煙草分別進行冷脅迫或PEG處理，處理時間為0、1、3、6、12和 24 h。在不同處理時間點分別用打孔器取樣，分別對樣品進行GUS染色和 GUS酶活力測定。

2 結果

2.1 啟動子的克隆

在已經獲得的SikCDPK1基因序列基礎上，利用TAIL-PCR法擴增雪蓮SikCDPK1的啟動子序列。經過3輪PCR，第一輪擴增的PCR產物均無特異條帶（圖2-A），第2輪PCR產物出現特異條帶（圖2-B），第3輪PCR 產物第2、3、4泳道出現單一的特異條帶（圖2-C），對該片段回收、測序后與SikCDPK1基因比對，確認其為 SikCDPK1的5'側翼序列。該序列長度1 042 bp，命名為pSikCDPK1。

圖2 SikCDPK1基因啟動子的克隆Fig. 2 Cloning of SikCDPK1 promoter

2.2 啟動子序列的功能預測

利用PlantCARE對克隆獲得的pSikCDPK1序列分析發現，序列中含有多個CAAT box 及TATA box保守元件，還有激素類響應元件，如參與MeJA的CGTCA-motif、TGACG-motif 元件，ABA誘導響應元件ABRE和DPBFCOREDCDC3，赤霉素響應元件TATC-box等，此外參與冷、脫水、鹽誘導、光響應的順式調控元件也在SikCDPK1啟動子中存在。不同順式作用元件的序列、功能、核心序列及其在啟動子區的分布情況見表2。

表2 啟動子 pSikCDPK1序列中的順式作用元件及功能Table 2 Cis-elements and functions in the promoter pSikCDPK1 sequence

2.3 啟動子驅動的GUS表達載體構建

將克隆的啟動子片段 pSikCDPK1和3個5'端缺失啟動子（P1、P2、P3）分別連接到植物表達載體pCAMBIA1304（有GUS，無啟動子）上，對重組質粒分別進行PCR（圖3-A）、測序和酶切鑒定，獲得大小為1 042、821、480和181 bp的目標基因片段和大于4 500 bp的載體片段（圖3-B，C），表明4個啟動子表達載體構建成功。

圖3 SikCDPK1啟動子的PCR擴增及表達載體雙酶切鑒定Fig. 3 PCR amplification of promoter SikCDPK1 and double restriction identification of expression vector

2.4 啟動子的GUS活性分析

將構建好的4個啟動子表達載體轉入到根癌農桿菌GV3101中，瞬時轉化煙草，用GUS進行染色，觀察煙草葉片的著色程度。如圖4所示，陰性對照（非轉基因型煙草）葉片中看不到任何著色情況（圖4-A）；由35S啟動子驅動的GUS陽性對照，葉片著色深（圖4-B）；SikCDPK1啟動子驅動GUS的葉片著色表現為整個葉片都有藍色，著色程度相對35S弱（圖4-C），缺失片段P1（821 bp）著色較其他缺失體明顯，面積大，且顏色相對較深（圖4-D），P2（480 bp）著色程度相對較低（圖4-E），面積大，P3（181 bp）僅零星有藍色斑點（圖4-F），著色面積最小且著色程度最低。說明啟動子全長P0與缺失體P1、P2、P3均能啟動報告基因的表達，啟動活性大小依次為 P0＞P1＞P2＞P3。

圖4 SikCDPK1啟動子瞬時轉化煙草GUS染色分析Fig. 4 GUS staining analysis of transient transformed tobacco with SikCDPK1 promoter

2.5 pSikCDPK1啟動子響應低溫和模擬干旱處理的表達活性

利用農桿菌介導法注射煙草葉片，以35S啟動子驅動的植株作為陽性對照，通過GUS染色來分析SikCDPK1啟動子在逆境脅迫條件下對報告基因的誘導特性。結果（圖5-A）表明，低溫處理下陽性對照組中煙草葉片著色都較深，pSikCDPK1啟動子驅動的GUS葉片著色情況隨著低溫處理時間的延長呈現出先加深再減弱的情況，它們的GUS酶活也是隨著低溫脅迫時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢，在3 h時達到了頂峰，此時GUS酶活為28.972 7 nmol 4-MU·min-1·mg-1。PEG處理條件下，pSikCDPK1啟動子驅動的GUS葉片著色情況與在低溫脅迫條件下的情況基本相似，即隨著脅迫處理時間的延長呈現出先加深再減弱的情況（圖5-B），它們的GUS酶活也是隨著低溫脅迫時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢，在3 h時達到了頂峰，GUS酶活為29.907 9 nmol 4-MU·min-1·mg-1。說明pSikCDPK1在低溫、干旱下，都能驅動GUS基因在煙草中的表達，pSikCDPK1活性和脅迫時間有關，下游報告基因表達強度和啟動子活性有關。

圖5 脅迫處理下GUS染色分析及酶活力的測定Fig. 5 Gus staining analysis and enzyme activity determination under stress treatment

3 討論

CDPKs是植物對抗逆境脅迫的一種重要的蛋白，CDPKs能夠在感知Ca2+信號時直接激活和調節靶蛋白，從而使靶蛋白正常發揮功能，在植物面對非生物脅迫時起到重要作用［6］。CDPKs相關功能的研究在雪蓮中也有一定的進展［4］，然而，目前對于這類基因功能的研究多是依據基因表達的時空模式或轉基因株系的表型分析，對基因的調控機制研究甚少。

啟動子通常被稱為“轉錄網關”，在植物基因的表達調控中起關鍵作用，啟動子的表達活性水平調控受到與啟動子中各種響應元件結合的轉錄因子以及其所形成的復合物來決定［7］。瞬時表達是檢驗啟動子是否具備啟動下游結構基因表達的活性功能的常用驗證方法［8］。啟動子的核心區域對基因的表達調控起關鍵作用，5'端分段缺失是尋找啟動子啟動活性關鍵區域的有效方法。為了探究SikCDPK1 基因啟動子的核心區域，本研究分別構建了全長啟動子和3個5'端缺失啟動子驅動的GUS重組表達載體，通過瞬時轉化煙草，利用GUS組織化學染色顏色深淺判斷不同長度啟動子的活性，結果發現不同長度啟動子的活性強弱不同，最小的缺失片段P3著色面積小且淺，說明該區間啟動活性較弱。缺失片段P2、P1著色依次加深，全長P0著色最濃，初步推斷該啟動子的核心啟動子區域可能位于P0與P2（-1 042- -408 bp）之間。

啟動子是重要的調控元件，在一定程度上決定了基因的表達時間和空間次序，通過研究啟動子的活性和功能，有助于深入研究基因的功能和表達調控機制。SikCDPK1基因可提高轉基因植物的耐干旱、低溫的能力。本研究發現，雪蓮SikCDPK1的啟動子區域中含有1個W-box、1個GT1和2個LTRE等與非生物脅迫及激素誘導相關的順式作用元件。其中W-box是可和特定WRKY轉錄因子相結合，而WRKY轉錄因子的不同成員可參與包括病害、高溫、干旱、高鹽等，還與SA、JA、ET等信號通路相關［9-14］。LTRE元件是與低溫脅迫相關的元件［15-19］。GT1元件在大豆中存在，且是響應鹽脅迫的主要順式作用元件［20］。為了解雪蓮SikCDPK1基因響應逆境的表達調控特性，本研究通過TAIL-PCR技術克隆到SikCDPK1基因的啟動子序列，啟動子序列預測發現該啟動子區域除了含有啟動子活性重要位點TATA-box和CAAT-box［21］外，還含有MYB-core、ACGTATERD1、LTRECOREATCOR15、CBFHV等和干旱、低溫相關的順式作用元件。在大豆和茶樹的相關研究中也有這些元件存在，發現它們在干旱和低溫誘導的基因表達中起作用［20，22］。

為探究這些元件是否在SikCDPK1基因的啟動子中起作用，本研究分別對全長啟動子驅動的煙草進行了不同時間的冷脅迫和PEG處理，并進行了GUS染色和酶活性測定，發現冷和PEG處理都可誘導GUS基因的表達，GUS基因的酶活性隨著冷和干旱處理時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，在處理3 h時酶活性最高，這說明低溫和干旱處理都可在短期內快速增強pSikCDPK1的啟動活性，pSikCDPK1活性和脅迫時間有關，pSikCDPK1的活性越高，下游報告基因表達的強度越強。推測SikCDPK1基因啟動子可能也會通過MYB-core、ACGTATERD1、LTRECOREATCOR15、CBFHV 等干旱、低溫相關的順式作用元件，調控SikCDPK1基因對干旱、低溫的響應時間和響應程度。

SikCDPK1基因啟動子序列中還發現有參與茉莉酸甲酯響應的CGTCA-motif、TGACG-motif，參與ABA誘導響應的ABRE和DPBFCOREDCDC3，參與赤霉素響應的TATC-box等激素響應元件，這些響應元件的具體功能以及調控方式也有待進一步研究和探討。這些研究將為深入探討SikCDPK1基因的上游調控序列和解析SikCDPK1基因響應逆境脅迫的調控機制提供了理論依據。

4 結論

成功克隆了雪蓮SikCDPK1基因的啟動子，通過GUS 組織化學染色和GUS酶活性測定證實了SikCDPK1啟動子具有啟動活性，低溫和干旱脅迫可在短期內快速增強SikCDPK1啟動子的活性，SikCDPK1基因啟動子可通過其相關順式作用元件調控下游基因的表達強度。