一種松材線蟲醛脫氫酶的基因克隆及其生化性質

李文碩 王林松 杜桂彩 郭群群 張廷婷 楊宏 李榮貴

（青島大學生命科學學院，青島 266071）

由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松萎蔫病已經在世界各地造成嚴重的生態環境破壞和巨大的經濟損失，是松樹的一種毀滅性災害［1］。中國于1982年在江蘇省南京市首次發現了松萎蔫病，隨后該病迅速擴散至其他省份［2］。該病的發生和傳播涉及多種因素，如松樹的抗性、昆蟲傳播媒介及線蟲攜帶的細菌等［3］。松萎蔫病的致病機制尚不清楚，目前尚未開發出針對該病有效且廉價的藥物［3］。

當松材線蟲感染松樹的木質部時，樹木的受損細胞可以釋放化學物質來刺激模式識別受體并激活寄主松樹的防御系統，使松樹產生增厚細胞壁，產生活性氧，并積累醇、醛和萜烯等次生代謝產物現象［4-6］。松材線蟲以松樹的管胞和射線細胞為食，并依靠體內的酶類抵御入侵宿主過程中遇到的防御阻礙［7-8］。松材線蟲體內各種酶類的研究已經成為松萎蔫病致病機制研究的熱點，過氧化物酶是松材線蟲應對寄主防御反應重要酶類，該酶由線蟲口針分泌至體外發揮作用，降低由寄主防御系統產生的活性氧對松材線蟲的傷害［9］。Fu等［10］克隆了一個在松材線蟲尾部表達的Bx-Prx基因，該基因表達的產物同屬于過氧化酶類，通過RNA干擾Bx-Prx的表達可以降低松材線蟲的繁殖率。細胞色素P450通路被認為是松材線蟲的主要解毒途徑［3，11-13］，干擾色素 P450家族 中 CYP33C9、CYP33C4、CYP33D3三個基因的表達，松材線蟲的活性和致病性均顯著降低［14］。

在之前的研究中，為了探究松材線蟲體內一種醇脫氫酶的生理功能，我們使用醇脫氫酶的特異性抑制劑甲吡唑處理松材線蟲，結果顯示松材線蟲的取食能力和運動能力均明顯降低，表明醇代謝途徑對松材線蟲生長發育發揮著重要作用［15］。醛脫氫酶是醇類物質代謝途徑中重要的一環，承擔著將毒性較大的醛類轉化為酸的重要功能［16］。轉錄組分析顯示，甲吡唑處理的松材線蟲，其體內一種編碼醛脫氫酶的基因表達水平顯著升高。本文通過研究該醛脫氫酶的理化性質，為深入了解該酶在松萎蔫病病理進程中的作用打下基礎，也為以醛脫氫酶為靶點的殺線藥物的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生松材線蟲取自嶗山（中國，青島市）上的枯萎黑松，將松枝剪成1 cm3左右的小塊，采用貝爾曼漏斗法分離野生松材線蟲［15］。將分離出的線蟲接種于長滿灰葡萄孢的馬鈴薯淀粉瓊脂培養基中，在25℃下避光培養一周左右［17］。本實驗所用的大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）菌株及表達載體pET-15b購自Novagen公司并由本實驗室保存。實驗所用的限制核酸內切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司（北京）；Taq DNA聚合酶、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（北京）；pMD-18T載體、RNA提取試劑RNAiso購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；乙醛購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自上海源葉生物科技有限公司；其他化學試劑為分析純級別，購自上海滬試實驗室器材股份有限公司；引物合成和質粒測序工作由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲總RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso試劑從松材線蟲中提取總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。以松材線蟲總RNA模板，按照寶日醫生物技術（北京）有限公司cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作，反轉錄mRNA生成cDNA第一鏈。

1.2.2 目的基因克隆及表達載體構建 根據轉錄組的測序結果，分別設計一對帶有Nde I和BamH I酶切位點的特異引物（引物序列見表1），以松材線蟲cDNA第一鏈為模板按如下程序擴增目的基因：94℃預變性 5 min；94℃變性 50 s，57℃退火 40 s，72℃延伸90 s，共進行35個循環。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收目的基因，16℃下與pMD-18T載體連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5α，在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB培養基篩選陽性克隆，挑取單克隆培養后提取質粒并測序，序列正確的質粒命名為pMD-18T-aldh。

表1 本試驗所用引物Table 1 PCR primers used in this study

pMD-18T-aldh經Nde I/BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離載體pMD-18T與aldh，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收aldh。用NdeI/BamHI雙酶切表達載體pET-15b后，經瓊脂糖凝膠電泳分離后，用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收pET-15b?；厥盏妮d體pET-15b和aldh混合后用T4DNA連接酶于16℃下連接過夜，連接產物轉化E. coli DH5α，在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB培養基篩選陽性克隆，挑取單克隆培養后提取質粒并測序，序列正確的質粒命名為pET-15b-aldh。

1.2.3 醛脫氫酶結構預測 醛脫氫酶的三級結構通過在線網站http：// www.sbg.bio. ic. ac.uk/ phyre2 /html/page..cgi?id=index預測。通過在線網站https：// www.novopro.cn /tools/ signalp.html預測醛脫氫酶是否含有信號肽。利用NPS@ SOPMA工具分析重組醛脫氫酶的二級結構。

1.2.4 表達及重組蛋白純化 將測序正確的表達載體pET-15b-aldh轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB培養基篩選陽性克隆，陽性克隆即為構建的工程菌，挑取單菌落于37℃、150 r/min 的搖床中培養過夜。按1.5%（體積比）的接種量將培養液接種至4 L LB液體培養基中（含100 μg/mL 氨芐青霉素）進行菌體擴大培養。當OD600等于1時加入β-異丙基硫代半乳糖苷（麥克林，上海）至終濃度為0.4 mmol/L 誘導目的蛋白表達，28℃誘導4 h。4℃，8 000×g，離心20 min收集菌體。菌體用結合緩沖溶液（20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3，5 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl）懸浮后，用超聲波破碎細胞，4℃，12 000×g，離心30 min獲得粗酶液。Ni-NTA樹脂用平衡緩沖液平衡處理后裝柱（1.2 cm×5.0 cm），加入粗酶液，然后用2種含有不同濃度咪唑的洗滌緩沖液進行逐步洗脫雜蛋白（洗滌緩沖液1：20 mmol/L Tris-Cl，pH8.3，30 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl；洗滌緩沖液 2 ：20 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3，63 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl），最后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-Cl，pH8.3，500 mmol/L 咪唑，500 mmol/L NaCl）洗脫目的蛋白，4℃條件下洗脫蛋白溶液對Tris-Cl緩沖液（10 mmol/L，pH 8.0）透析脫鹽。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，并用分離膠濃度為12% 的SDS-PAGE 分析純化結果［18］。

1.2.5 重組醛脫氫酶米氏常數的測定 在25℃下，以甲醛為底物測定重組醛脫氫酶的米氏常數。反應根據Okibe的方法稍作更改，反應總體積為 2 mL，含 5 mmol/L Tris-Cl 緩沖液（pH 8.3），3 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 氧化型NAD和0.32 mg重組醛脫氫酶，以及不同濃度的甲醛（15 mmol/L-40 mmol/L）［19］。反應時間10 min，通過測定反應體系在340 nm 吸光度變化求出反應速度，采用雙倒數作圖法求出醛脫氫酶的Km值，還原型NADH在340 nm 的毫摩爾消光系數為6.22 mmol/L/cm［20］。使吸光度增加0.01所需的酶量定義為1 U。

1.2.6 不同pH值對醛脫氫酶反應速度的影響 在不同pH值下分別測定醛脫氫酶反應速度。在25℃下，反應時間5 min。采用如下6種不同緩沖液體系創造不同的pH環境：0.2 mol/L NaAC-HAC緩沖液（pH5.5）；0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH6.5）；0.2 mol/L Tris-Cl緩沖液（pH7.5）；0.2 mol/L Tris-Cl緩沖液（pH8.5）；0.2 mol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH9.5）；0.2 mol/L Gly-NaOH緩沖液（pH10.5）。反應總體積為2 mL，向上述不同的反應緩沖液分別加入0.3 mmol/L KCl、5 mmol/L 氧化型 NAD、50 mmol/L 乙醛和0.63 mg重組醛脫氫酶。在340 nm下測定反應體系吸光度的變化，計算反應速度。

1.2.7 溫度對醛脫氫酶反應速度的影響 在不同溫度條件下（15℃-50℃）分別測定醛脫氫酶的反應速度。反應時間為5 min的反應體系含有0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH6.5），0.3 mmol/L KCl，5 mmol/L 氧化型NAD，50 mmol/L 乙醛和0.63 mg重組醛脫氫酶，反應總體積為2 mL。在340 nm下測定反應體系吸光度的變化，計算反應速度。

1.2.8 金屬離子對醛脫氫酶反應速度的影響 在25℃下，在5 mmol/L Tris-Cl緩沖液（pH8.3）中分別加入10 mmol/L 氧化型NAD，0.32 mg重組醛脫氫酶，35 mmol/L 甲醛，及終濃度為3 mmol/L 不同金屬離子（Mn2+、Na+、Ca2+、Ni2+、K+、Fe3+），反應體系為2 mL，反應時間5 min。在340 nm下測定反應體系吸光度的變化，計算反應速度。

1.2.9 醛脫氫酶對不同底物的催化能力 在25℃下，在5 mmol/L Tris-Cl緩沖液（pH8.3）中，測定以不同醛類為底物時酶的反應速度，用于測試的醛類有：香草醛、戊二醛、甲醛、乙醛和4-（二甲氨基）-苯甲醛（簡寫為PDAB）。反應總體積為2 mL，反應時間5 min，反應體系中分別加入終濃度為35 mmol/L上述不同的醛，10 mmol/L 氧化型NAD和0.32 mg重組醛脫氫酶，3 mmol/L MgCl2。在340 nm下測定反應體系吸光度的變化，計算反應速度。

2 結果

2.1 目的基因的克隆及表達載體的構建

使用RNAiso試劑成功從松材線蟲中提取了總RNA并反轉錄獲得了cDNA第一鏈。以此為模板通過RT-PCR成功擴增出一段約1.3 kb的片段，將該片段連入pMD-18T構建pMD-18T-aldh。測序結果顯示，擴增得到的片段與GenBank序列號為CAD5152421.1的序列一致。該片段有完整的開放閱讀框，大小為1 353 bp，編碼451 個氨基酸殘基（圖1），根據EXPASY 分析，醛脫氫酶理論大小約為51 kD，理論等電點（pI）為4.8。

圖1 松材線蟲aldh基因序列和推測的氨基酸序列Fig.1 Sequences and predicted amino acid sequences of gene aldh from PWN（pine wilt disease）

2.2 重組醛脫氫酶的結構預測

使用在線工具預測得到的重組醛脫氫酶的三維結構如圖2-A所示。通過NPS@ SOPMA工具分析，結果如圖2-B顯示，醛脫氫酶二級結構有較多的α螺旋結構（藍色），占47.33%，其次是紫紅代表的無規卷曲占29.78%。利用在線工具預測重組醛脫氫酶信號肽，重組醛脫氫酶不具有信號肽結構。

圖2 醛脫氫酶三維結構（A）和二級結構預測（B）Fig.2 Prediction of the 3-dimensional structure（A）and 2 -dimensional structure（B）of aldehyde dehydrogenase

2.3 重組醛脫氫酶的表達及純化

轉化表達載體pET-15b-aldh的大腸桿菌BL21（DE3）經IPTG誘導后積累大量目的蛋白（圖3），經SDS-PAGE分析，結果顯示，利用鎳柱親和層析純化出一種相對分子量約為51 kD的蛋白，與aldh編碼的醛脫氫酶的理論大小一致。

圖3 重組醛脫氫酶的表達與純化Fig. 3 Expression and purification of the recombinant alde-hyde dehydrogenase

2.4 重組醛脫氫酶米氏常數的測定

以反應速度的倒數（1/v）對底物濃度的倒數（1/［s］）作圖，如圖4所示，根據Lineweaver-Burk方程式求得醛脫氫酶的Km值。當用甲醛為底物，氧化型NAD為輔因子時，Km為27.87 mmol/L。

圖4 通過Lineweaver-Burk計算醛脫氫酶的Km值Fig. 4 Km of the recombinant aldehyde dehydrogenase calculated by Lineweaver-Burk plot

2.5 pH對重組醛脫氫酶反應速度的影響

反應體系的pH值對醛脫氫酶反應速度的影響如圖5所示，pH值的變化范圍從5.5-10.5，重組醛脫氫酶在不同環境中表現出了不同反應速度，從圖中可知重組醛脫氫酶的最適pH值為7.5，當pH值為10.5時，醛脫氫酶檢測不到催化活性。

圖5 不同pH值對醛脫氫酶反應速度的影響Fig. 5 Effects of pH values on aldehyde dehydrogenase reaction rates

2.6 不同溫度對醛脫氫酶反應速度的影響

溫度對醛脫氫酶催化活力影響較大，當測試溫度范圍為15℃-50℃，由圖6可知重組醛脫氫酶的最適溫度為25℃，當反應溫度達到50℃時，已檢測不到催化活性。

圖6 不同溫度對醛脫氫酶活性的影響Fig. 6 Effects of temperatures on aldehyde dehydrogenase activity

2.7 金屬離子對醛脫氫酶反應速度的影響

向測試體系分別添加終濃度為3 mmol/L的不同的金屬離子，與完全不添加金屬離子相比，Fe3+和Ni2+能夠提高酶的活力，Mn2+、Na+、K+和Ca2+對重組醛脫氫酶的活性均有抑制作用（圖7）。

圖7 不同金屬離子對醛脫氫酶反應速度的影響Fig. 7 Effects of metal ions on aldehyde dehydrogenase reaction rates

2.8 醛脫氫酶對不同醛類的催化能力

在供試的5種醛類中，重組醛脫氫酶對香草醛顯示了較高的催化活力（圖8），酶活力為（4.06±0.20）U，對乙醛的催化活性最低，酶活僅為（0.866±0.12）U。對結構復雜的芳香族醛類4-（二甲氨基）-苯甲醛的沒有檢測到催化活性。

圖8 醛脫氫酶對不同醛類的催化活性Fig. 8 Catalyzed activities of aldehyde dehydrogenase on different aldehydes

3 討論

松樹對松材線蟲的抗性與其體內次生代謝物有關。馬尾松種源的抗性與α-松油醇、長葉烯、雪松烯和金合歡烯等成分呈正相關［21］。馬尾松富含松醇，其含量也與馬尾松的抗逆性密切相關［22］。松材線蟲侵染黑松后，宿主產生的揮發性成分中檢測到乙醇和萜類化合物［23］。已有研究表明，松樹產生的揮發物反式-2-己烯醛有較好的殺線活性［24］，松樹正常的脂類代謝也會產生丙二醛。松材線蟲在入侵宿主的過程中，需要克服宿主產生的這些醇類、醛類等次生代謝產物，才能成功定殖并致病。前期我們研究發現，松材線蟲的醇脫氫酶能夠催化多種醇類化合物的脫氫反應生成醛類化合物［15］，但無論宿主體內還是松材線蟲代謝產生的醛類物質仍然具有較大毒性，需要進一步氧化為酸類成分才能進一步解毒和利用，推測松材線蟲體內的醛脫氫酶就有此種功能，因此，松材線蟲醛脫氫酶可能成為松萎蔫病防治的一個潛在靶點，但目前尚未有松材線蟲醛脫氫酶的研究報道。

通過生物信息學方法，我們在GenBank中發現了13個與醛脫氫酶的編碼基因高度同源的序列（未公開結果），本文通過RT-PCR的方法從松材線蟲體內成功克隆出一個編碼醛脫氫酶的cDNA，并成功構建了表達載體。轉入大腸桿菌BL21（DE3）中構建了工程菌，IPTG誘導該基因的高效表達，并利用親和層析的方法純化獲得該基因編碼的醛脫氫酶?；钚苑治鲲@示，以甲醛為底物，以氧化型NAD為輔酶，通過雙倒數作圖法求得醛脫氫酶的Km值為27.87 mmol/L，與其他使用NAD作為輔因子的醛脫氫酶相比，來自太平洋火色桿菌（Flammeovirga pacifica）的一種醛脫氫酶，其Km值為（421±23.5）μmol/L；大腸桿菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（C192A）的Km值為（0.074±0.004）mmol/L［25-26］，松材線蟲的醛脫氫酶具有中等的Km值。在對不同底物的催化活性的實驗中，松材線蟲的醛脫氫酶表現出了對香草醛較好的催化活性，這可能是松材線蟲在松樹體內抵御香草醛的重要手段，而香草醛存在于感病樟子松木質部和赤松樹皮部位［27-28］。

已有很多研究報道金屬離子顯著影響醛脫氫酶的活性，嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌（Geobacillus thermodenitrificans）NG802 的醛脫氫酶可被 Mg2+、Ca2+和Mn2+的激活，但受到Co2+、Cu2+和Ni2+的抑制［29］。本研究發現Fe3+和Ni2+可提高松材線蟲醛脫氫酶的活性，而Ca2+、Mn2+、Na+和K+可降低酶活性，這為醛脫氫酶的開發利用打下基礎。此外，對該酶的一級結構比對分析發現，該醛脫氫酶內位于催化中心的保守氨基酸殘基并不是半胱氨酸（Cys），而是亮氨酸（Leu），但其C-端緊鄰Leu殘基的是組氨酸殘基（His），而不是常見的非極性氨基酸殘基（圖9），推測His參與了醛類化合物的催化作用。因此，對松材線蟲醛脫氫酶的深入研究有助于我們了解它們的理化性質并為松萎蔫病藥物的研發提供更多的線索。

圖9 多序列對比不同來源的醛脫氫酶的一級結構Fig.9 Multiple sequences alignments of primary structures of aldehyde dehydrogenases from different sources

4 結論

本研究克隆了松材線蟲體內一個編碼醛脫氫酶的cDNA，獲得了重組醛脫氫酶，研究了該醛脫氫酶的生化性質，證實以甲醛為底物的醛脫氫酶Km值為27.87 mmol/L，最適pH值為7.5，最適溫度為25℃，Fe3+和Ni2+可提高其酶活性，Ca2+、Mn2+、Na+和K+可降低該酶活性。重組醛脫氫酶對5種測試醛類化合物顯示出不同的催化活性，香草醛是其最佳底物。