丙泊酚對H2O2 誘導的HT22 細胞凋亡的保護作用

李婕 王小波 李春梅

當前人口老齡化問題越來越嚴重,與之相關的疾病負擔正日益受到社會的關注,其中年發生率顯示不斷提升的病癥成為備受關注的重點疾病,其中就包括神經退行性疾病。全球疾病負擔研究顯示,目前約有超過10 億人受到神經退行性疾病的影響,每年約有近700 萬人死于該類疾病。同時,在世界衛生組織的相關預測中得知,預計到2040 年,該疾病的致死率將超過癌癥［1］。雖然神經退行性疾病尤其是阿爾茲海默癥(AD)和帕金森氏病(PD)等是不同性質的疾病,其明確的發病機制目前也尚不清楚,但研究表明,氧化應激(Oxidative Stress)被認為是AD 和PD 等神經退行性疾病發病的重要原因［2］。超氧陰離子、羥自由基及H2O2等ROS 積累和氧化損傷與神經退行性疾病的發病進程密切相關［2］。

沉默信息調節因子2 相關酶1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1) 屬于一種基于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸而形成的組蛋白脫乙酰化酶,可使P53、Ku70、FoxOs、過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子(PGC-1α)和核轉錄因子-κB(NF-κB)等多種蛋白脫乙酰化,在氧化應激和細胞凋亡發生時有一定的作用呈現。在氧化應激過程中,將導致細胞中P300/CBP 對FoxO 家族的乙酰化修飾作用提升,乙酰化的FoxO 家族可促進下游靶分子P53、P16 及P21 的轉錄和表達,誘導細胞凋亡和衰老。而SIRT1 可使FoxO 家族去乙酰化,促進DNA 損傷修復和抑制細胞衰老和凋亡等多種生物過程,預防各種疾病的發生［3,4］。

丙泊酚作為臨床麻醉中常用的鎮靜藥物,因具有起效迅速、短效、復蘇迅速、可控性好、副作用少、首相迅速分布及消除等優點被廣泛應用于外科麻醉［5,6］。本研究采用H2O2對HT22 細胞實施處理,以完成體外神經細胞損傷模型的創建,期間通過丙泊酚執行干預操作,最終觀察丙泊酚是否可抑制H2O2損傷的神經元細胞凋亡,以及是否通過SIRT1-FoxO1 信號通路起到保護作用,為臨床治療、臨床用藥及改善患者預后提供一定的理論和實驗依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 丙泊酚(北京費森尤斯卡比醫藥有限公司)；海馬神經元HT22 細胞株(北京北納創聯生物技術研究所)；胎牛血清、1640 培養基、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司；NAD/NADH 檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)；SIRT1 抗體、Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2、Cyt C、β-actin 抗體均購自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 儀器 電泳儀(BioRad)、垂直電泳槽(BioRad)、濕式轉膜儀(BioRad)、化學發光成像儀(Tanon)、制冰機(三洋)、4 度離心機(Thermo)、超潔凈工作臺(江蘇通凈)、水平脫色搖床(其林貝爾)、Infinite M200 Pro 型酶標儀(瑞士Tecan 公司)。

1.3 方法

1.3.1 HT22 細胞的培養 采用含10%胎牛血清的1640 培養基培養HT22,置于溫度37 ℃,且含有5%CO2的專用箱中進行培養。待細胞密度達80%～90%進行0.25%胰蛋白酶消化HT22 傳代培養,以進行后續實驗研究。

1.3.2 CCK-8 法檢測細胞存活率和篩選H2O2合適作用濃度 取培養對數期HT22 細胞,0.25%胰蛋白酶消化后調整密度至 6×104/ml,取96 孔板按每孔 100 μl的體積進行鋪板。分別設對照組、H2O2組及丙泊酚組,對照組加入含1%FBS 的培養基,H2O2組加入含100 μM H2O2的1%FBS 的培養基,丙泊酚組在100 μM H2O2干預后,加入含50 μM 丙泊酚的1%FBS 培養基,培養6 h后,棄上清,加入含10%CCK-8的1640培養基,37℃孵育2 h,酶標儀450 nm 處測吸光度。

1.3.3 DCFH-DA 檢測細胞內ROS 水平 選用對數生長期的 HT22 細胞,消化收集后用二十四孔板鋪板,24 h 細胞貼壁后,根據實驗進行相應處理因素添加。干預結束后,棄掉培養基,4℃預冷PBS 洗HT22 1 次,棄PBS。加入終濃度為5 μM 的熒光探針工作液,避光孵育20～30 min。PBS 洗HT22 1 次,檢測各孔熒光強度。

1.3.4 NAD/NADH 檢測試劑盒檢測NAD 選用對數生長期的 HT22 細胞,消化收集后用六孔板以每孔4×105個細胞進行鋪板,24 h 細胞貼壁后,根據實驗進行相應處理因素添加。棄培養基,加入200 μl 的NAD/NADH 提取液,輕吹裂解細胞；按照NAD/NADH 檢測試劑盒說明檢測NAD 水平。

1.3.5 Westernblot 檢測HT22 細胞內SIRT1、FoxO1及細胞凋亡相關蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2、Cyt C 的表達水平 選用對數生長期的 HT22 細胞,消化收集后用六孔板以每孔 4×105個細胞進行鋪板,24 h細胞貼壁后,根據實驗進行相應處理因素添加。干預結束后,需要將上清液等剔除,并對細胞進行收集。然后,向其中加入適量的裂解緩沖液,以此在冰上勻漿裂解,溫度為4℃,時間為0.5 h,12000×g 離心,最終取上清液,實施蛋白定量操作。此后,獲取適量的蛋白上樣,并進行電泳分離,所用為十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉到固相支持體聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,10%脫脂奶粉封閉PVDF 膜45～60 min,含一抗的抗體稀釋液與PVDF 膜共孵育4℃過夜,TBST 搖床洗膜3 次,5～10 min/次,含二抗的抗體稀釋液與PVDF 水平搖床室溫共孵育45～60 min,TBST 搖床洗膜3 次,5～10 min/次,配制適量發光液,Tanon 全自動化學發光圖像分析系統檢測。Image J 分析凈光密度。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,兩獨立樣本比較采用獨立樣本t檢驗；多組分析采用方差分析；組間比較采用SNK 或LSD 法。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2對HT22 細胞存活率的影響 用50、100、200、300、400、500 μM 不同濃 度H2O2處 理HT22細胞24 h 后,與對照組相比,隨著H2O2濃度的增加,HT22 細胞存活率逐漸下降,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。H2O2誘導細胞損傷的IC50 為234.13 μM。與對照組比較,100 μM H2O2處理HT22 細胞24 h 后,HT22 細胞存活率為75.62%。100 μM H2O2組細胞存活率明顯低于對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。本研究通過實驗摸索和調整結合參考文獻最終確定100 μM 作為本次實驗的處理濃度。

圖1 H2O2 對HT22 細胞存活率的影響注：與對照組比較,aP＜0.05

圖2 H2O2 對HT22 細胞活力的濃度抑制曲線

2.2 丙泊酚對H2O2誘導的HT22 細胞存活率的影響H2O2組細胞存活率顯著低于對照組,丙泊酚組高于對照組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)；H2O2和丙泊酚聯合處理組細胞存活率高于H2O2組,低于丙泊酚組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 丙泊酚對H2O2 誘導的HT22 細胞存活率的影響

2.3 丙泊酚對H2O2誘導的HT22 細胞內ROS 的影響H2O2組細胞內ROS 顯著高于對照組,丙泊酚組低于對照組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯合處理組細胞內ROS 低于H2O2組,高于丙泊酚組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 丙泊酚對H2O2 誘導的HT22 細胞內ROS 含量的影響

2.4 丙泊酚對H2O2誘導的HT22 細胞凋亡的影響H2O2組細胞內Cleaved-Caspase3、Bax、Cyt C 蛋白的表達水平顯著高于對照組,丙泊酚組顯著低于對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯合處理組細胞內Cleaved-Caspase3、Bax、Cyt C 的表達水平低于H2O2組,高于丙泊酚組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖5,圖6,圖7,圖8。

圖5 Westernblot 檢測凋亡相關蛋白的表達

圖6 四組凋亡相關蛋白Bax 的表達

圖7 四組凋亡相關蛋白Cleaved-Caspase3 的表達

圖8 四組凋亡相關蛋白Cyt C 的表達

2.5 丙泊酚對H2O2誘導的HT22 細胞內SIRT1-FoxO1 信號通 路的影 響 H2O2組細胞 內SIRT1 和FoxO1 蛋白的表達水平明顯低于對照組,丙泊酚組明顯高于對照組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯合處理組細胞內SIRT1 和FoxO1 的表達水平高于H2O2組,低于丙泊酚組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖9,圖10,圖11。

圖9 Westernblot 檢測SIRT1 和FoxO1 的表達

圖10 四組SIRT1 蛋白的表達

圖11 四組FoxO1 蛋白的表達

2.6 丙泊酚對H2O2誘導的HT22 細胞內NAD 含量的影響 H2O2組細胞內NAD 水平明顯低于對照組,丙泊酚組明顯高于對照組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。H2O2和丙泊酚聯合處理組細胞內NAD 水平高于H2O2組,低于丙泊酚組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖12。

圖12 丙泊酚對H2O2 誘導的HT22 細胞內NAD 含量的影響

3 討論

大量文獻查閱后發現,氧化應激與神經退行性疾病的發生有不可分割的聯系,表現在神經細胞中的某些物質水平增加,比如ROS［7］。在大腦運行期間,相關組織對氧氣的消耗量較大,加之脂質含量相對較高,所以會使得相應細胞中的上述物質大量形成并堆積,因此大腦組織易受氧化應激的影響。同時因神經元質膜中不飽和脂肪酸比較多,所以神經元對ROS 高度敏感。氧化應激是PD 和AD 等神經退行性疾病出現的關鍵原因［2］。研究表明海馬神經元為AD 患者大腦組織中最先作出反應的神經元細胞,而且其中還有大量的內源性糖皮質激素受體,導致其更容易被氧化應激所“控制”,也就使得氧化應激與AD 的發生、發展都有著密切關聯［7］,可見氧化應激是導致該類疾病發生以及加重的重要因素之一；同時神經元對于氧化應激高度易感,本研究采用H2O2對HT22 細胞實施處理以完成體外神經細胞損傷模型的創建。實驗結果表明,H2O2可降低 HT22 細胞存活率,且具有濃度依賴性。

研究人員總結臨床病例時發現,丙泊酚可通過減少術中血流量,縮短腦損傷患者的康復時間而滿足腦外科手術的基本鎮靜需求［8］。實驗研究表明丙泊酚可通過PI3K/Akt 信號通路,提高顱內血腫SD 大鼠的神經功能評分,減輕SD 大鼠的神經水腫和炎癥［9］。丙泊酚可通過降低腦局部血流量、降低神經系統高量代謝、減輕水腫及減少出血周邊壞死等作用減少腦組織損傷,從而起到保護作用［6］。研究表明腦出血患者行血腫摘除術時應用丙泊酚鎮靜可明顯降低其死亡率,改善術后認知功能,但其具體作用機制不清［6］。因此本研究采用H2O2對HT22 細胞實施處理以完成體外神經細胞損傷模型的創建,并應用丙泊酚進行干預,在細胞水平上觀察到丙泊酚對神經元細胞起到了一定的保護作用。本實驗研究結果表明丙泊酚可提高H2O2損傷后的HT22 細胞存活率,減少細胞凋亡。進一步實驗觀察到,丙泊酚可降低H2O2損傷后的HT22 細胞內ROS 含量,這一結果表明丙泊酚可降低HT22 細胞的氧化損傷,從而起到保護細胞的作用。本研究在體外實驗證實了丙泊酚在腦外科臨床應用中可能的重要保護作用,為臨床治療、臨床用藥及改善患者預后提供一定的理論和實驗依據。

研究表明SIRT1-FoxO1 信號通路會對氧化應激等反應進行一系列調節,以參與到細胞從生長到凋亡的全過程［10］。氧化應激可降低細胞內SIRT1 酶的活性,而SIRT1 則是在FoxO 途徑下實現對抗氧化物表達的強化,同時抑制SIRT1 活性可上調NF-κB 信號通路,誘導炎癥反應［10］。研究表明人成神經細胞瘤SHSY5Y 細胞經β-拉帕醌誘導后,細胞內SIRT1 活性會出現一定的提升,同時FoxO1 核轉位也提升,自噬水平增加,細胞毒性降低。同時提高細胞內SIRT1 的活性,可減少PolyQ 蛋白聚合物并降低細胞毒性,同時伴有FoxO1表達上調［11］。同時另有研究表明。過表達SIRT1,會使得PolyQ 毒性擴散的影響降低,新桿狀線蟲神經元損傷程度也會減小,不過這個過程中應有FoxO 及其伴侶 β-連環蛋白參與。因此SIRT1-FoxO 還有一定的保護神經元的能力［12,13］。本研究發現H2O2可降低SIRT1 和 FoxO1 的表達,表明氧化應激具有降低細胞內SIRT1 酶的活性和降低細胞抗氧化應激的能力。在氧化應激過程中,將導致細胞中P300/CBP 對FoxO 家族的乙酰化修飾作用提升,乙酰化的FoxO 家族可促使下游靶分子P53、P16 及P21 的轉錄和表達,誘導細胞凋亡和衰老。而SIRT1 可使FoxO 家族去乙酰化,促進DNA 損傷修復和抑制細胞衰老和凋亡［3,4］。為了進一步探討丙泊酚干預后減輕細胞損傷可能的分子機制,本實驗發現,在H2O2誘導的損傷模型中,丙泊酚處理后,SIRT1 和 FoxO1 表達增加。這一結果提示丙泊酚能夠激活SIRT1-FoxO1 信號通路減輕細胞內ROS 水平和降低細胞凋亡。

綜上所述,丙泊酚對H2O2誘導HT22 細胞損傷具有的保護作用,其作用機制可能與激活SIRT1-FoxO1信號通路來減輕氧化應激水平,降低細胞凋亡有關。