miR-499a-5p通過靶向TLR2抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡

楊偉，王雁，李俊杰，王燕瓊，陳文棟

(昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，云南 昆明 650032)

急性心肌梗死是臨床上常見的心血管疾病，由于冠狀動脈內斑塊破裂、血栓形成導致冠狀動脈血管閉塞、心肌細胞缺血缺氧損害[1]。然而心肌細胞在長時間缺血缺氧狀態下可導致細胞內線粒體功能障礙，啟動氧化應激反應，激活細胞凋亡途徑，最終引起心肌細胞損害[2]。因此，抑制氧化應激反應、降低心肌細胞凋亡率對減輕心肌細胞缺血缺氧損傷的具有重要意義。近年來，微小RNA(miRNA)在人類疾病中的作用已經逐漸受到大量研究的認可，尤其在心血管疾病中的作用[3]。Zhu等[4]指出，miR-499a-5p下調可能與心肌細胞缺氧發生氧化應激反應，并誘導心肌細胞凋亡途徑相關，然而其具體作用靶點研究尚未完善。Toll樣受體2(Toll-like receptors 2，TLR2)是一種參與非特異性免疫的蛋白分子，其通過識別不同病原體相關分子模式，激動信號級聯反應，進而促進免疫應答[5]。Zhang等[6]指出，miR-499可能參與IPostC的心臟保護，通過抑制局部和全身TLR2激活、炎癥和PKC信號傳導。因此，本研究擬探討miR-499a-5p與TLR2的靶向關系，并分析其對缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細胞H9c2(購自北京北納創聯生物公司)；杜氏細胞培養基(DMEM)、胎牛血清(購自Hyclone公司)；pGL3-Basic質粒載體(購自上海康朗生物科技有限公司)；脂質體Lipofectamine3000(購自Invitrogen公司)；實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(購自日本TaKaRa公司)；B淋巴細胞瘤因子2XL(Bcl2-xL)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的第一抗體(購自abcam公司)，丙二醛(MDA)(S0131S)、超氧化物歧化酶(SOD)(S0103)、活性氧(ROS)(PS835)試劑盒、雙熒光素酶報告基因、miR-499表達檢測試劑盒(均購自上海碧云天研究所)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素-碘化丙啶(V-FITC/P1)凋亡檢測試劑盒(購自南京森貝伽生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養、模型建立及分組干預

將H9c2細胞株置于5%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基進行常規培養傳代，取對數期心肌細胞進行分組干預，每組干預條件重復5次：(1)對照組心肌細胞置于常氧培養箱中傳代培養；(2)將其余細胞置于1% O2、94% N2、5% CO2條件下缺氧處理3 h，在37 ℃ 5% CO2條件下復氧培養6 h，制造缺氧/復氧模型細胞，設為模型組；根據實驗設計情況，將細胞分為miR-NC組、miR-499a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-499a-5p組、miR-499a-5p+pGL3-Basic組、miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組。將miR-NC、miR-499a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-499a-5p、miR-499a-5p+pGL3-Basic、miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2按照1∶3量加入脂質體試劑，混勻轉染至模型組心肌細胞H9c2，轉染5 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h后，對各培養基采樣進行qRT-PCR，確認轉染是否成功。

1.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-499a-5p、TLR2mRNA的表達[7]

收集各組細胞，用Trizol法提取細胞中RNA，采用逆轉錄試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)合成cDNA，反應體系5 μL(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL)，輕柔混勻后進行加入DNA擴增儀中。反應條件為：37 ℃ 15 min反轉錄，85 ℃ 5 s反轉錄酶失活后，4 ℃保存。最后采用qRT-PCR試劑盒對cDNA中的miR-499a-5p、TLR2 mRNA進行熒光定量PCR，qRT-PCR反應體系20 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ (2×) 10 μL、PCR正反向引物(10 μM)各0.8 μL、 ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 2 μL、滅菌蒸餾水6 μL,進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 120 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，共進行40次循環。最終在軟件中生成PCR循環曲線及循環閾值(Ct)，以GAPDH為內參，以2-△△Ct計算miR-499a-5p、TLR2 mRNA的表達量。見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot檢測細胞中TLR2、Bcl-xL、Bax、Caspase-3的蛋白表達

收集各組H9c2細胞，加入RIPA蛋白裂解使其充分裂解后，提取細胞中的總蛋白；將蛋白質置于在100 ℃沸水中變性10 min，取上清液進行蛋白電泳上樣；采用轉膜儀將上樣蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，轉膜完成后用5%脫脂牛奶封閉處理2 h，而后在一抗 [包括兔抗TLR2(abcam，ab209216)、兔抗Bcl-xL(abcam，ab32370)、兔抗Bax(abcam，ab32503)、兔抗Caspase-3(abcam，ab32351)] 溶液中以4 ℃處理過夜；次日取膜洗凈后置于二抗溶液中，37 ℃孵育2 h；最后在凝膠儀中曝光得到蛋白條帶，根據蛋白條帶灰度值計算蛋白的相對表達量。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組H9c2細胞，將細胞接種在6孔板內，嚴格按照V-FITC/P1凋亡試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)說明書操作，取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-APC混勻后于室溫避光孵育5 min。加入10 μL的碘化丙啶(PI)20 μg/mL，并加400 μL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，立刻進行流式檢測。流式細胞儀檢測時，Annexin V-APC用633 nm激發器激發，最大發射波長660 nm，建議使用FL4或RL1通道檢測。凋亡率(%)=早期凋亡(%)+晚期凋亡(%)

1.6 酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測細胞中ROS、SOD、MDA含量

收集各組H9c2細胞，棄去培養液加入染色工作液于37 ℃孵育40 min，PBS緩沖液洗脫后，嚴格遵循試劑盒說明書操作步驟，完成一抗反應、二抗結合、底物制備及顯色，最后將樣本直接置于酶標儀中讀取吸光度(波長405～450 nm)并計算MDA(碧云天)、SOD(碧云天)和ROS(碧云天)含量。每個樣本做3個復孔，上述實驗重復3次取均值。

1.7 雙熒光素報告基因檢測[8]

通過使用Rnahybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)生物信息學數據庫檢索miR-499a-5p靶向目的基因TLR2的結合位點。在H9c2細胞中構建雙熒光素酶基因報告分析。使用PCR擴增TLR2的野生型 (WT)3′-UTR序列，并將其克隆到pmirGLO載體中，采用點突變法擴增TLR2突變株 (MUT)3′-UTR序列，并克隆到pmirGLO載體中，建立熒光素酶報告質粒。再將已載入基因片段的pGL3-Basic與脂質體混合分別與miR-NC、miR-499a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-499a-5p共同轉染至H9c2細胞。以每孔100 μL的量加入細胞懸液，緩慢搖15 min后，將細胞裂解液吸至1.5 mL離心管，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清液，96孔板中加入Luciferase Assay ReagentⅡ (LARⅡ)工作液100 μL，加入20 μL細胞裂解液，測定記錄內參(firefly luciferase，Fl)值。加入100 μL Stop&Glo Reagent，測定記錄Renilla luciferase (Rl)值，即為報告基因發光值。上述操作嚴格遵從雙熒光素酶報告基因測試試劑盒(碧云天)說明書。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 miR-499a-5p及TLR2在A/R模型H9c2細胞中的表達

與對照組相比，模型組TLR2蛋白的表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-499a-5p組TLR2蛋白表達降低，anti-miR-499a-5p組TLR2蛋白表達升高，anti-miR-499a-5p組TLR2蛋白表達水平高于miR-499a-5p組，上述差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

與對照組相比，模型組miR-499a-5p低表達，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-499a-5p組高表達，anti-miR-499a-5p組低表達，miR-499a-5p組與anti-miR-NC組相比呈高表達，上述差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.2 過表達miR-499a-5p對A/R模型H9c2細胞氧化應激及凋亡的影響

與miR-NC組相比，miR-499a-5p組細胞凋亡率下降，Bax、Caspase-3低表達，Bcl-xL高表達，ROS、MDA含量降低，SOD水平升高，上述差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3及圖4。

2.3 過表達TLR2對A/R模型H9c2細胞氧化應激及凋亡的影響

與miR-499a-5p+pGL3-Basic組相比，miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組細胞中細胞凋亡率上升，Bax、Caspase-3高表達，Bcl-xL低表達，ROS、MDA含量上升，SOD水平下降，上述差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5及圖6。

2.4 miR-499a-5p靶向TLR2

與miR-499a-5p+pGL3-Basic組比較，miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組TLR2-WT細胞熒光活性降低(t=14.393，P<0.001)，TLR2蛋白呈低表達(t=16.042，P<0.001)；與anti-miR-499a-5p+pGL3-Basic組比較，anti-miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組TLR2-WT細胞熒光活性上升(t=6.227，P<0.001)，TLR2蛋白表達呈高表達(t=8.697，P<0.001)，可見，miR-499a-5p靶向作用于TLR2的表達。見表2。

表2 miR-499a-5p靶向

3 討論

本研究通過建立缺氧/復氧模型，觀察模型心肌細胞與正常心肌細胞時發現，模型細胞內miR-499a-5p呈低表達，TLR2蛋白高表達；在模型內各組比較中發現，與miR-NC組相比，miR-499a-5p組miR-499a-5p呈高表達，而anti-miR-499a-5p呈低表達，而TLR2的表達則與miR-499a-5p表達相反；在觀察過表達miR-499a-5p或過表達TLR2時發現，與氧化應激及細胞凋亡相關蛋白表達時呈現相反的趨勢。

國外一項臨床研究報告[9]顯示，發生不穩定型心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死患者發病后3 h內血清miR-499a-5p表達水平降低，提示miR-499a-5p可能與心肌細胞損傷有關，但其對心肌細胞的作用機制及靶基因研究尚不明確。Zhao等[10]通過制造缺氧/復氧模型研究指出，miR-499a-5p在心肌細胞中表達顯著降低，而過表達miR-499a-5p后心肌細胞的凋亡率下降；而另一相關研究[6]指出，miR-499a-5p通過抑制缺血再灌注模型中TLR2信號傳導，抑制如白細胞介素-6、白細胞介素-1β等促炎細胞因子的級聯反應，發揮對心肌細胞的保護作用。TLR2是近年來缺血再灌注損傷及心肌保護作用的新興治療靶點，此前的基礎研究[11-12]指出，通過抑制TLR2的激活，可明顯降低心肌梗塞面積及局部和全身炎癥細胞，而單核細胞中TLR2的表達水平或可作為心肌損傷程度的參考指標。雖然以往研究確立了miR-499a-5p對心肌細胞的作用及其可能與抑制TLR2表達相關，但對于缺氧/復氧心肌細胞的作用及miR-499a-5p與TLR2二者之間的靶向關系研究尚不明確。本研究通過觀察H9c2A/R模型細胞發現，與正常H9c2細胞相比，A/R模型細胞內miR-499a-5p低表達，TLR2卻呈高表達，這與上述研究基本一致。在通過進一步對比miR-499a-5p、miR-NC、anti-miR-499a-5p、anti-miR-NC中發現，在miR-499a-5p降低的組別中，TLR2均呈高表達，而在miR-499a-5p升高的組別中，TLR2均呈低表達，因此二者之間可能存在負調控關系。

在進一步研究H9c2細胞凋亡率時發現，miR-499a-5p過表達組凋亡率均低于對照組，而TLR2過表達組凋亡率均高于對照組。心肌細胞在缺氧條件下會發生線粒體功能障礙，線粒體內細胞色素C(Cyt-C)激活并被釋放入胞質，通過級聯反應激活Caspase-3蛋白并啟動線粒體凋亡程序[13-14]。Bcl-xL和Bax是一對負責調控線粒體膜上Cyt-C的蛋白分子，Bax蛋白可增加Cyt-C的釋放，促進凋亡作用，而Bcl-xL蛋白作用與其正好相反[15-16]。本研究通過對各模型組細胞進行Western blot檢驗，對比上述參與細胞凋亡的相關蛋白水平發現，與miR-NC組相比，miR-499a-5p組上調Bcl-xL蛋白表達，而Bax及Caspase-3蛋白均表達下調，而過表達TLR2的miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組下調Bcl-xL蛋白表達，而Bax及Caspase-3蛋白均表達上調。此外，在進行心肌細胞凋亡研究的同時，采用ELISA法檢測心肌細胞中ROS、SOD及MDA的水平，結果顯示，過表達miR-499a-5p的組別中ROS及MDA水平明顯降低，SOD水平升高，而過表達TLR2的組別中，ROS及MDA水平明顯上升，SOD水平降低，這結果與細胞凋亡率及其相關蛋白表達量波動情況相互吻合。另外，雙熒光素報告基因檢測結果顯示，miR-499a-5p與TLR2確實存在靶向關系。因此，miR-499a-5p一方面可能通過靶向下調TLR2的表達，抑制TLR2對免疫應答的作用，減少促炎細胞的累積及炎癥因子對心肌細胞的破壞，降低氧化應激反應程度，從而發揮保護心肌細胞的作用；另一方面，miR-499a-5p通過抑制Bax、Caspase-3蛋白的表達，上調Bcl-xL蛋白的表達，抑制心肌線粒體啟動凋亡程序，進而降低心肌細胞凋亡率，減輕損傷程度。

綜上，miR-499a-5p與TLR2為靶向關系，可能通過抑制局部和全身 TLR2 激活，降低心肌細胞凋亡率及氧化應激反應，發揮保護心肌細胞的作用。