基于wnt1信號通路探討黑枸杞對肝干細胞的影響*

馬 力 馬 靜 張常喜

黑枸杞為茄科、枸杞屬植物(Lycium Ruthenicum Murr)的干燥成熟果實。其味甘、性平，入肝、腎經，具有補肝強腎之功效，是一種常用的藥食同源類中藥。有研究表明，黑枸杞營養豐富，其多種營養成分皆為人體所需要，伍玉輝等[1]發現黑枸杞中含有大量氨基酸種類繁多，其中為人體所需的氨基酸有18種，還包括有機酸、脂肪、微量元素、蛋白質等,其次有研究發現黑枸杞中有超過blueberry的大量的黑果色素—天然原花青素(OPC)，是天然野生植物中發現的含量最高的野生植物。而且在實際應用中發現，黑枸杞在臨床上治療肝病具有很好的療效，其對肝纖維化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等多種肝臟疾病具有很好的預防和治療效果，證明了黑枸杞的補肝功效，但目前黑枸杞補肝的作用機制尚未闡明。除此之外它還具有抗疲勞、抗腫瘤、增強免疫功能、保護血管內皮細胞、調節血脂、延緩衰老等作用。而在中醫相關黑枸杞的研究中顯示黑枸杞具有補肝腎、明目、健脾益胃、補腦以及抗衰老等作用。本研究擬以中醫理論為指導，運用現代科學技術和手段，研究黑枸杞補肝作用機制，為更好地開發應用黑枸杞提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗肝干細胞SD大鼠肝干細胞系WB-F344[許可證號：SCXK(湘)2016-0002，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司]。

1.1.2 實驗黑枸杞黑枸杞(寧夏杞愛原生黑果枸杞股份有限公司)

1.1.3 實驗試劑Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(CW0581M，CWBIO 康為世紀)，UltraSYBR Mixtur(CW0957M，CWBIO 康為世紀)，Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO 康為世紀)，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒(CW2569M，CWBIO 康為世紀)。

1.1.4 實驗儀器-80 ℃冰箱(BDF-86V348，BIOBASE)，移液槍(20～200 μl，0.1～2.5 μl，0.5～10 μl，eppendorf)，單道可調移液器(0.5～10 μl，20～200 μl，100～1000 μl，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，干式電加熱器(GL-150，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，微型離心機(D1008E，SCJLOGEX)，旋渦混合器(XH-C，常州越新儀器制造有限公司)，低溫高速離心機(TGL-16G，常州中捷實驗儀器制造有限公司)，紫外可見分光光度計(UV-1600PC，上海美譜達儀器有限公司)，熒光PCR儀(CFX ConnectTM實時，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠藥物血清制備藥物血清制備：SD大鼠2只，雄性，連續藥物(0.15 g/ml的黑枸杞溶液)灌胃7 d(每天1次)，末次給藥后2 h，麻醉心臟取血，后靜置離心分析血清，于-80 ℃保存備用。

1.2.2 肝干細胞培養實驗藥物血清處理組加入SD大鼠含藥血清處理(含藥血清量10%)，空白組加10%磷酸鹽緩沖液(PBS),空白血清處理組加不含藥胎牛血清(FBS)10%。WB-F-344細胞的傳代：棄去培養上清，1×PBS洗兩遍，0.25%胰酶消化3 min，加入培養基終止消化并懸起細胞；收集細胞至10 ml離心管中，1000 r/min離心 3 min，棄盡上清，加入DMEM完全培養基吸管吹勻；將上述細胞懸液稀釋至適宜細胞密度后加入準備好的培養瓶中，于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養。取血后加抗凝劑,靜置1～2 min,置入離心機內以3000 r/min離心15 min,用移吸管吸出分散的血清(上層乳黃色的上清液),反復2次得較純血清,放置-20 ℃冰箱儲存。

1.2.3 糖原染色(PAS)實驗培養狀態良好的細胞，去除培養基，加4%組織細胞固定液固定15 min，然后用自來水沖洗3 min，再用蒸餾水浸洗2次，1 min/次，然后再滴加過碘酸溶液，室溫靜置7 min，再用自來水沖洗1 min,蒸餾水浸洗2次，1 min/次，然后再滴加Schiff Reagent，置于室溫陰暗處，浸染15 min，自來水沖洗10 min，最后再滴加蘇木素染色液，染 2 min，酸性分化液分化2～5 s，自來水沖洗10 min，再用蒸餾水沖洗，鏡檢。

1.2.4 肝干細胞激光共聚焦實驗激光共聚焦實驗鋪板：棄去培養上清，1×PBS洗兩遍，0.25%胰酶消化3 min，加入培養基終止消化并懸起細胞；收集細胞至10 ml離心管中，1000 r/min離心3 min，棄盡上清，加入DMEM完全培養基吸管吹勻后將細胞培養液鋪于6孔板中，24 h后細胞貼壁后按實驗方案處理細胞。(1)細胞的固定 在培養板中將已爬好細胞的培養皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定 15 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min；(2)細胞的通透 0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。(3)封閉 PBS浸洗培養皿3次，每次5 min，移液槍吸干PBS，在培養皿內滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。(4)免疫反應 一抗 移液槍吸掉封閉液，不洗，培養皿內滴加足夠量的稀釋好的一抗CK19(1∶200)，AFP(1∶50)，37 ℃孵育3 h。(5)加熒光二抗PBS浸洗培養皿3次，每次3 min，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3(1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min。(6)核染定位 復染核:滴加DAPI避光孵育5 min,對標本開始染核,用PBS清洗剩余的DAPI;封片:用50%甘油密封培養皿,并且在熒光顯微鏡下觀察收集圖片。

1.2.5 肝干細胞PCR實驗(1)細胞收集：①用移液槍吸掉培養皿中的細胞培養液。②在培養皿中加入Trizon 裂解液，根據細胞量每皿加入1 ml Trizon。③用移液槍吹打，使貼壁細胞懸浮與裂解液充分接觸，將全部細胞懸液轉移到1.5 ml 離心管中，保存在-80 ℃，防止降解。(2)RNA提取：①向以上溶液中加入氯仿，每使用1 ml Trizon后加入0.2 ml 氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s，冰盒上放置5 min。②4 ℃，12 000 r/min離心15 min，此時樣品分成3層：紅色有機相層、中間層、無色水相層，RNA主要在水相層中，把水相層(約500 μl)轉移到一個新的預冷1.5 ml RNase-Free 離心管中。③在得到的水相溶液中加入等體積預冷的70%乙醇，顛倒混勻。④將上述溶液加入到已裝入收集管的吸附柱RM中，在 4 ℃，12 000 r/min 離心30 s，棄流出液。⑤加入700 μl RW1洗滌沉淀。4 ℃，12 000 r/min 離心30 s，棄流出液。⑥加入500 μl RW2洗滌沉淀。4 ℃，12 000 r/min 離心30 s，棄流出液。⑦重復步驟⑥。⑧棄流出液后，空轉離心2 min，棄流出液。⑨冰盒上存放5 min,晾干。將吸附柱裝入到一條新的預冷1.5 ml RNase-Free離心管中,加入 30 μl 無RNase的水,完全水解RNA,靜置3 min,4 ℃,12 000 r/min離心1 min。把回流液再加入到吸附柱當中,靜置3 min,4 ℃,12 000 r/min離心1 min。所得的RNA保持在-80 ℃,避免分解。(3)RNA濃度、純度測定：①打開紫外可見分光光度計預熱20 min，從30 μl體系的RNA溶液中吸取5 μl，與45 μl的RNase free water混合均勻(即將RNA溶液稀釋10倍)。②在260 OD下測定其數據并記錄，再在280 OD下測定數據并記錄。③根據公式計算：A260 ×稀釋倍數×40=RNA ng/μl(濃度);1.8≤A260/280≤2.0(純度)。見表1。(4)逆轉錄將RNA通過逆轉錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成CDNA：①逆轉錄體系 參照試劑盒說明書以4.9 μg總RNA為模板進行逆轉錄，按下表配制反應體系混合液。見表2。②渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。③加入①②③后70 ℃孵育10 min，再迅速冰浴 2 min。④再加入④⑤⑥50 ℃孵育15 min，85 ℃孵育 5 min。反應結束后，短暫離心，置于-80 ℃冰箱，以防降解。(5)熒光定量PCR 根據各指標基因序列，設計其特異檢測引物，以細胞的總RNA為模板，q-PCR檢測各基因的表達情況。見表3。

表1 RNA濃度及純度表

表2 逆轉錄反應體系表

表3 引物信息表

1.2.5 統計學方法實驗所用數據皆運用GraphPad Prism 5來統計分析，經t檢驗顯著性差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 (PAS)實驗肝干細胞(Liver stem cell)與肝細胞的生長、發育、增殖甚至纖維化程度等有著密切的關系，為了研究黑枸杞的補肝機制，本研究中選用肝干細胞系WB-F344細胞進行實驗。陽性物質呈紅色或紫紅色，細胞核呈藍色，細胞質呈深淺不一的紅色。此結果提示黑枸杞能夠促進肝干細胞誘導分化成肝細胞。實驗結果與前期研究所發現的黑枸杞具有促進肝干細胞增殖，抑制其凋亡的結論相符合。見圖1。

圖1 肝干細胞(PAS)實驗結果

2.2 肝干細胞激光共聚焦結果采用免疫熒光檢測技術研究黑枸杞溶液對肝干細胞分化的影響。實驗時，將細胞固定、打孔、封閉后進行免疫反應，通過加入甲胎蛋白(AFP)、細胞角蛋白19(CK-19)或白蛋白(Albumin,ALB)孵育一定時間，再加入熒光二抗Cy3，染細胞核，再通過共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況。其中紅色熒光為檢測的目的蛋白，藍色熒光為細胞核。與空白組和不含藥組相比，含藥組的紅色熒光很明顯。此結果表明黑枸杞應該能夠誘導肝干細胞向肝細胞、膽管上皮細胞分化的作用。見圖2。

圖2 肝干細胞激光共聚焦實驗結果

科學研究表明肝干細胞的生長、增殖和分化受各種細胞因子控制，如肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)[2]等能促使肝干細胞的增殖，轉化生長因子β(TGF-β)[3]等能誘發其凋亡,并抑制生長,表明細胞生長因素可以在重度肝損害后肝干細胞的啟動、生長和分化過程調節中起作用。此外,調控肝干細胞增生與分離涉及細胞外基質、細胞內轉錄因子、信號通道Wnt、Notch、Hedgehog、BMP/TGFβ、PI3K、AKT等[4]，Wnt-βcatenin信號通道與肝細胞的形成相關，Wnt1量的變化決定著卵圓細胞向肝細胞的分化，Notch信號通道與肝細胞增殖、膽管及新生血管形成相關，對肝臟損傷后重塑起重要作用[5]。肝干細胞誘導分化決定著肝細胞再生和肝損傷修復，直接影響肝病的治療和預后。通過提取大鼠肝干細胞中的RNA，并將RNA逆轉錄為cDNA，再進行熒光定量PCR實驗。PCR結果顯示，CYP1A1、wnt-1和notch2的mRNA的表達均降低，該結果提示黑枸杞可能通過下調wnt-1和notch2通路，誘導肝干細胞分化。見表4、表5。

注：與空白對照組比較，*P<0.05。圖3 肝干細胞PCR實驗結果條形圖

表4 黑枸杞對CYP1A1 Notch2 Wnt-1表達的影響

表5 黑枸杞對CYP1A1 Notch2 Wnt-1影響的顯著性差異分析表

總之，研究結果表明，黑枸杞可通過下調wnt-1和notch2通路(PCR實驗)，促進肝干細胞向肝細胞、膽管上皮細胞分化，調節肝細胞再生和修復(PAS和PCR對CYP1A的檢測)。

3 討論

有多種研究表明Wnt1信號能夠調控機體的發育、生長、衰老和死亡, 成體組織細胞的分化、增殖及凋亡都和它有著密不可分的關系[6,7]。當肝臟受損時，殘存的肝組織就會再生，而肝臟的再造功能與肝干細胞也是離不開的[8]。肝干細胞是指產生在成熟肝的Herring狹隙中的一類有雙向分化潛能的細胞,在肝細胞遭受破壞時或肝細胞的再生遭到抑制時,它們能夠生長、分化形成不同的肝細胞與膽管細胞,從而參加肝構造與功能的重組，具有干細胞特點的一類細胞[9,10]。而且肝干細胞來源也有不同，由此可以將肝干細胞分為2類，即：肝源性肝干細胞、非肝源性肝干細胞[11]。肝源性肝干細胞又可以分化為肝卵圓細胞等多種細胞形態，而當肝臟受到損傷時，肝卵圓細胞就會分化為肝細胞，幫助肝臟再生[12-14]。有實驗發現Wnt-βcatenin信號通路與肝臟細胞的形成相關，其中Wnt1量的變化決定著卵圓細胞向肝細胞的分化[15，16]。相關研究表明卵圓細胞有導致膽管癌或肝細胞癌的傾向，而阻斷Wnt1信號通道可阻礙卵圓細胞分化為肝細胞[17]。細胞色素P450(Cytochrome P450)是一組含亞鐵血紅素的同工酶，是至關重要的一類酶，它在人體中有許多作用，例如：可以幫助一些藥物進行生物轉化(即藥物代謝)；它具有催化功能，可以對一些物質進行催化作用，例如許多前致癌物和前毒物的活化過程就離不開其的催化作用。有研究表明，當細胞色素CYP1A1被激活后，能引起細胞內鈣釋放、活性氧增多進而產生細胞內的氧化應激和內質網應激，激發Caspase通路誘導細胞凋亡，產生肝毒性作用[18]，當阻斷CYP1A1的表達，可以有效減少肝臟的損傷。Notch信息通道由Notch受體、Notch配體、CSLDNA融合蛋白質、其他的效應物和Notch的調控分子等構成。Notch信號通路與肝纖維化相關,研究發現Notch能與生長轉化因子相互作用增強或減少EMC,選擇性的介導纖維化產生[19,20]。本研究采用pcr技術檢測黑枸杞作用于肝干細胞系WB-F344后，通過抑制Wnt1等相關信號分子的表達，從而對肝臟起到保護作用。因此得出結論加藥血清對肝干細胞系WB-F344能產生影響。