KPNA2 在乳腺癌組織中的表達及臨床病理意義

魏麗麗，郝瑞卿，王華瑛

（昌邑市婦幼保健院病理科1，兒科2，婦科3，山東 昌邑 261300）

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥死亡的主要原因，占確診癌癥的24%，女性癌癥死亡原因中占15%[1，2]。我國近10年來乳腺癌的發病率和死亡率呈上升趨勢[3]。隨著醫學研究的進展，乳腺癌患者的5 年生存率顯著提高。從1989 年到2016 年，乳腺癌死亡率下降了40%[4]。但對于轉移和復發的乳腺癌，至今為止仍是治療的難點。尋找用于腫瘤早期診斷和指導預后的新的臨床指標是近幾年癌癥研究的熱點。在癌癥發展中會出現細胞運輸機制的功能障礙。蛋白質在細胞質和細胞核之間的轉運是由核胞漿轉運蛋白介導的。Karyopherin α2（KPNA2）是核胞漿素α 家族的成員之一。KPNA2 約為58 kDa，可能通過調節癌相關轉運蛋白的亞細胞易位參與致癌作用[3-6]。有研究顯示[7-10]，KPNA2 在多種惡性腫瘤中過度表達，如肝細胞肝癌、非小細胞肺癌、口腔鱗狀細胞癌、腎臟透明細胞癌等，與腫瘤的發生發展有密切相關性。雖然KPNA2 在乳腺癌中的表達及其與各臨床病理參數之間的關系，但目前國內報道較少[11，12]。本研究通過免疫組化方法檢測乳腺癌組織中KPNA2和β-catenin、cyclinD1 蛋白的表達，并結合TCGA數據庫資料探討KPNA2 在乳腺癌中的表達水平與各臨床病理參數之間的意義，進一步研究KPNA2在乳腺癌發生發展過程中的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取昌邑市婦幼保健院病理科2014 年1 月-2019 年8 月未經放化療的乳腺浸潤性導管癌標本120 例設為實驗組，另選取50 例實驗組的距離癌旁1 cm 的正常乳腺組織作為對照組。均為女性，年齡31～85 歲，中位年齡54 歲。病理診斷均為浸潤性導管癌。

1.2 方法 采用免疫組化方法檢測組織中KPNA2、β-catenin 及cyclinD1 的表達。所有標本中性福爾馬林固定。KPNA2、β-catenin、cyclinD1 兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶100）購于武漢三鷹生物技術有限公司。即用型ER、PR、HER-2、Ki-67 抗體為福建邁新生物技術有限公司。所有乳腺癌蠟塊標本均經臨床、高年資病理醫師確診。常規石蠟4 μm 切片。免疫組化采用SP 法。用PBS 液替代一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 依據美國臨床腫瘤學會ASCO 分級對KPNA2、β-catenin、cyclinD1、ER、PR、HER-2、Ki-67行結果判讀。KPNA2、cyclinD1、ER、PR、Ki-67 陽性：呈棕黃色顆粒定位于細胞核。β-catenin、HER-2 陽性：呈棕黃色顆粒定位于細胞膜。染色陽性的腫瘤細胞面積＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計數0、1、2、3、4 分。腫瘤細胞著色強度分別標記-、+、++、+++，各計數0、1、2、3 分。兩者相乘，＜6 分判讀為低表達，≥6 分判讀為高表達。

1.4 統計學分析 所有數據采用SPSS18.0 統計軟件處理，計數資料以[n（%）]表示，比較行χ2檢驗；計量資料使用（）表示，組間比較行t檢驗。采用Pearson 相關性分析法分析KPNA2、β-catenin 及cyclinD1 與乳腺癌臨床病理參數及預后的相關性。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KPNA2、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌中的表達KPNA2、cyclinD1 定位于細胞核，在正常乳腺組織中一般弱表達或者陰性，在低級別乳腺癌中呈低表達，在高級別乳腺癌中呈高表達。β-catenin 定位于細胞膜，在正常乳腺組織中一般弱表達或者陰性，在低級別乳腺癌中呈低表達，在高級別乳腺癌中呈高表達。Ki-67 定位于細胞核，在增殖活躍的乳腺癌細胞中呈高表達，見圖1。

圖1 正常乳腺組織及乳腺癌免疫組化表達（HE×400）

2.2 KPNA2、β-catenin、cyclinD1 與臨床病理參數間的關系 KPNA2、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌中高表達率分別為53.30%（64/120）、49.10%（59/120）、50.80%（61/120）；KPNA2、β-catenin、cyclinD1 在 乳腺癌中的表達高于正常乳腺組織（P＜0.05）；KPNA2、β-catenin、cyclinD1 高表達與腫瘤TNM 分期、淋巴結轉移、組織學分級、Ki-67 指數高密切相關（P＜0.05），但與ER、PR、HER-2 的表達、腫瘤大小、年齡無關（P＞0.05），見表1。

表1 乳腺癌中KPNA2 表達與臨床病理參數的關系[n（%）]

表1（續）

2.3 KPNA2、β-catenin、cyclinD1 之間的相關性分析KPNA2 的表達分別與β-catenin（r=0.350，P=0.010）、cyclinD1（r=0.370，P=0.010）呈正相關，β-catenin 的表達與cyclinD1 的表達呈正相關（r=0.320，P=0.030）。

3 討論

KPNA2 是由一個N 端親水結合區、一個中心疏水區和一個短的酸性的C 端組成。KPNA2 參與細胞膜與細胞核的物質轉運過程，通過將DNA 雙鏈斷裂修復復合物MRN 導入細胞核參與DNA 損傷修復相關[4]。研究顯示，在多種癌中存在細胞膜細胞核轉運過程的異常。KPNA2 作為核轉運蛋白家族成員之一，在多種惡性腫瘤中呈高表達，對腫瘤發生、細胞分化和轉錄調控有影響，其高表達與包括結直腸癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、卵巢癌和肝細胞肝癌等多種上皮源性惡性腫瘤預后不良有關[8，13-15]。由此可見，KPNA2 很可能作為評估預后的獨立指標。本研究前期通過分析TCGA 數據庫結果顯示，KPNA2 在乳腺癌組織中呈現高表達，并且KPNA2 高表達的乳腺癌患者預后不良，提示KPNA2 可能作為評估乳腺癌預后的指標。

對于KPNA2 在腫瘤中的作用機制，近幾年也有一些深入的研究。KPNA2 的敲除降低了肝癌細胞的遷移和增殖能力，而KPNA2 的過度表達則增加了這些惡性特征，這可能是通過調節了細胞的周期和DNA 復制[8]。在口腔鱗狀細胞癌中敲除KPNA2 基因減少了細胞的遷移和侵襲[10]，敲除KPNA2 會抑制舌鱗狀細胞癌細胞的轉移、凋亡和增殖。p53 可能是參與舌鱗狀細胞癌cal-27 細胞KPNA2 功能的重要途徑[16]。敲除膠質母細胞瘤細胞株U87 和U251 中KPNA2 基因，腫瘤的增殖和侵襲性也伴隨著下調，表明KPNA2 調控c-Myc 轉錄中起著潛在的作用[17]。在頭頸部鱗狀細胞癌患者評估接受放射（化療）治療的細胞質和核位置KPNA2 表達的預后實驗中發現，KPNA2 在細胞質和細胞核核低表達也可預測經放射治療頭頸部鱗狀細胞癌的不良預后[18]。然而，KPNA2在乳腺癌中的表達研究甚少，尤其是聯合β-catenin、cyclinD1 的研究探討KPNA2 在乳腺癌中作用機制的報道少見。Wnt 信號通路在細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程，以及在細胞癌變、腫瘤侵襲等病理過程中均發揮了重要的調控作用，已經成為細胞生物學和分子生物學研究的熱點。β-catenin 介導的信號通路是Wnt 信號傳導通路中的經典信號通路，cyclinD1 是β-catenin 的下游靶基因[19]。

本研究結果顯示，KPNA2、cyclinD1 定位于細胞核，在正常乳腺組織中一般弱表達或者陰性，在低級別乳腺癌中呈低表達，在高級別乳腺癌中呈高表達。β-catenin 定位于細胞膜，在正常乳腺組織中一般弱表達或者陰性，在低級別乳腺癌中呈低表達，在高級別乳腺癌中呈高表達。Ki-67 定位于細胞核，在增殖活躍的乳腺癌細胞中呈高表達，這與TCGA 的數據庫分析結果相吻合。KPNA2、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌中的表達高于正常乳腺組織（P＜0.05）；KPNA2、β-catenin、cyclinD1 高表達與腫瘤TNM 分期、淋巴結轉移、組織學分級、Ki-67 指數高密切相關（P＜0.05），但與ER、PR、HER2 的表達、腫瘤大小、年齡無關（P＞0.05），表明KPNA2、β-catenin、cyclinD1 與乳腺癌的發生發展密切相關。

Pearson 相關性分析顯示，KPNA2 的表達分別與β-catenin（r=0.350，P=0.010）、cyclinD1（r=0.370，P=0.010）呈正相關，β-catenin 的表達與cyclinD1 的表達呈正相關（r=0.320，P=0.030），這說明KPNA2在乳腺癌中的作用機制與β-catenin 和cyclinD1 的表達相關，分析原因為KPNA2 可能通過Wnt 通路作用于乳腺癌的侵襲發展過程。

目前乳腺癌的治療主要通過傳統的手術、放療、化療、內分泌治療。并且近年來國家通過大力發展兩癌普查工作，乳腺癌的早期發現和治療明顯提高了乳腺癌患者的預后。但是乳腺癌的復發和轉移仍然是目前治療的難點[20]。因此尋找新的用于臨床治療的基因靶點是當今乳腺癌研究的熱點。本研究結果表明KPNA2 可能作為腫瘤治療的研究方向。

綜上所述，KPNA2、β-catenin 及cyclinD1 的表達與乳腺癌的惡性程度、高侵襲性及增殖指數高有關。KPNA2 高表達提示乳腺癌患者預后不良，可能用于臨床預后指導，其作用于乳腺癌的發生發展機制可能與Wnt 通路相關。