單分子免疫檢測技術的研究進展

張杏羨

（天津華興醫院檢驗科，天津 300270）

生物分子的定量檢測是實現疾病診斷與健康監測的重要方式，傳統的免疫學檢測方法包括酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化學發光法（chemi luminescence，CL）等，其檢測靈敏度多限制在10-14～10-12mol/L，無法滿足疾病的早期診斷需求[1]。對此，臨床提出采用單分子免疫檢測技術（single molecule detection，SMD），用以提高免疫檢測靈敏度。單分子免疫檢測是一種“數字化”免疫檢測技術，可將免疫復合物限制在極小范圍內（nl 以下），對產生的信號進行絕對計數，其靈敏度高達10-18mol/L，可充分滿足多種生物標志物的檢測需求[2]。目前，單分子免疫檢測模式可分為原位檢測與隨機分配檢測，前者所需儀器昂貴，對操作者要求較高，當前難以實現臨床應用[3]。隨機分配檢測則包括微陣列芯片與微液滴兩種形式，其中，基于微陣列技術的單分子免疫檢測已實現一定的自動化與商業化，是當前單分子檢測最常用技術，而Quantarix 公司的Simoa 是目前最具代表性的單分子免疫檢測技術[4]。本文以Simoa 為代表，對單分子免疫檢測的技術原理及臨床應用進行綜述，以期為超高靈敏度檢測方法的進一步開放提供理論基礎。

1 技術原理

以Simoa 為例，基于微陣列芯片的單分子免疫檢測是在毫米級芯片上雕刻（或澆筑）成千上萬個微米級微井，每個微井體積約40 fl 左右，隨后將免疫復合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率熒光顯微鏡對熒光點進行計數，依據泊松分布理論，計算同時含珠子與熒光產物孔的數量/含珠子孔總數的比值，以此確定測試樣品中的蛋白質濃度[5]。相較于傳統檢測方式，以Simoa 為代表的單分子免疫檢測技術可通過數字方式確定標志物濃度，其靈敏度高，可同時完成多達10 種目標分子的檢測，且重復性好、線性范圍高、靈活度強，可依據試驗目的進行方案開發與優化[6]。近年來，磁珠的全自動化檢測發展逐漸成熟，僅需增加磁珠分配和信號讀取模塊，便可實現單分子免疫檢測的全自動。目前，Quanterix Simoa HD-1 數字式單分子免疫陣列分析儀這一全自動方案已進入市場應用，前景廣闊。

2 臨床應用

目前，單分子免疫技術主要應用于生物標志物的檢測，包括蛋白質、核酸與生物小分子等，可準確監測生物標志物變化，有助于疾病的早期診斷與預后評估。研究證實[7，8]，單分子免疫技術具有超高靈敏度，其靈敏度與核酸檢測較為相似，且檢出限低，大大避免了靈敏度不足引起的假陰性，在神經退行性疾病、腫瘤、傳染病等領域均具有理想檢測價值。

2.1 在神經退行性疾病領域中的應用 神經退行性疾病是神經元結構與功能退化引起的功能障礙性疾病，包括阿爾茲海默癥（alzheimer disease，AD）、多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）及脊髓小腦性共濟失調（spinocerebellar ataxias）等，早期診斷尤為重要。現階段，神經絲蛋白（neurofilament protein，NFP）、β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）、tau（T-tau）蛋白和磷酸化tau（P-tau）蛋白等均為神經退行性疾病的常用生物標志物[9]。當神經元膜結構受損，相關標志物可釋放入組織液中，最終游離于腦脊液與血液中，隨著病情進展，其標志物水平可發生不同程度變化[10]。因此，通過腦脊液與血液的標志物檢測，可獲取相關疾病的動態信息。研究發現[11]，受到血-腦屏障的影響，血液中的標志物濃度遠低于腦脊液，且無法用現有手段準確檢測。因此，臨床多以腦脊液作為此類疾病的檢測標本，但腦脊液采集需穿刺取樣，創傷較大，不利于臨床推廣，相較而言，血液檢測不僅取樣方便、損傷較小，且易于保存，整體成本較低[12]。基于此，積極尋求血液替代腦脊液的檢測方式，是改善標志物檢測體驗的重要方向，而單分子免疫檢測技術的出現恰好滿足了以上需求。借助單分子免疫檢測技術的超高靈敏特性，可充分檢測出血液樣本中的生物標志物水平[13]，在神經性退行性疾病的診斷中具有重要意義。

2.1.1 阿爾茲海默癥 阿爾茲海默癥是典型的神經退行性疾病，其生理表現主要為Aβ 蛋白沉積與神經纖維纏結（neurofibrillary tangles）的形成，其中神經纖維纏結是由Tau 蛋白組成，因此，檢測其Aβ 蛋白與Tau 蛋白濃度，是獲取其病情信息的重要方式[14]。Mielke MM 等[15]采用單分子檢測技術對464 名認知正常者的血漿總Tau 含量進行了檢測，結果顯示，認知正常者血漿總Tau 水平每升高1 個log 單位，其認知障礙風險可增加2.5 倍。Hwang SS 等[16]對耗散型石英晶體微量天平（QCM-D）技術與Simoa 技術在Aβ 蛋白檢測中的應用價值進行了對比，發現Simoa 的靈敏度為QCM-D 技術的500 倍，其檢測限分別為0.22 nmol/L 與125 nmol/L。由此可見，單分子免疫技術對阿爾茲海默癥標志物具有積極檢測價值，有助于該病發生風險及病情進展的評估。

2.1.2 多發性硬化癥 多發性硬化癥屬于炎癥性神經退行性疾病，據Ferraro D 等[17]研究證實，神經絲輕鏈（neurofilament light，NfL）與多發性硬化癥患者疾病嚴重程度及殘疾進展相關聯，該生物標志物有作為多發性硬化癥疾病活動度的潛力。因此，臨床多以NfL 作為多發性硬化癥疾病的敏感生物標志物，用于監測組織損傷和MS 的治療效果[18]。Disanto G等[19]采用單分子陣列對健康對照組（n=254）與兩個獨立多發性硬化癥組（n=142、246）的血清NfL 水平進行了檢測，結果表明，單分子陣列技術的檢測靈敏度是酶聯免疫吸附試驗與電化學發光檢測的126、25 倍，該法可準確量化健康對照組中預期的低NfL濃度，有助于異常值與正常值的準確區分。綜合可見，單分子免疫檢測對多發性硬化癥標志物具有較高靈敏度，診斷價值顯著。

2.1.3 脊髓小腦性共濟失調 脊髓小腦性共濟失調是遺傳性共濟失調的主要類型。Wilke C 等[20]研究指出，NfL 可作為神經元損傷的標志物，在退行性共濟失調中發揮外周生物標志物作用，用于預測脊髓小腦性共濟失調的小腦萎縮與臨床進展。Ljungqvist JC等[21]采用新型超靈敏單分子陣列技術對患者血清NfL 濃度進行了測定，檢出效果顯著。綜上可知，單分子免疫檢測技術可有效測定脊髓小腦性共濟失調的血清生物標志物，有助于疾病的檢出與鑒別。

2.2 在傳染病領域中的應用 目前，傳染病檢測多集中于病原體自身標志物與細胞因子等方面。在病原體標志物的檢測中，高分子免疫檢測技術對病原蛋白的檢測靈敏度較高，可作為核酸檢測的有效補充手段，對感染的診斷與病情監測具有重要意義[22]。在細胞因子檢測方面，已有研究證實[23]，高分子免疫檢測技術可檢出血液中82%的細胞因子，而ELISA 法只能檢出25%。此外，高分子免疫檢測可在傳染病潛伏期和免疫反應前，檢測其生物標志物，實現更早期的實時診斷，為傳染病篩查、治療與疾病監測提供有利幫助，對傳染病傳播概率的下降具有重要價值。

2.2.1 獲得性免疫缺陷綜合征 獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）簡稱艾滋病，由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染引起，其免疫相關性病毒蛋白含量是反映疾病情況的重要標志物，其中HIV p24 抗原是最豐富的HIV 蛋白，但常規方式尚無法早期檢測其HIV 特異性抗體[24]。基于此，有學者開發了超靈敏p24 定量分析的高分子免疫檢測技術，用以測定HIV 變化，其檢出限與定量限分別為2.5 fg/ml、7.6 fg/ml，較傳統免疫測定法高出400 倍[25]。在一項針對成人患者抗逆轉錄病毒治療研究中[26]，利用高分子免疫檢測技術對HIV 生長情況進行了測定，研究發現，潛伏感染過程中HIV指數級復制僅發生于CD32-CD4+T 細胞中，只能通過此類高分子免疫檢測技術檢測到。由此可見，高分子免疫檢測技術對潛伏期HIV 具有良好檢出作用，有利于AIDS 病情的阻斷與控制。

2.2.2 結核病 結核病（tuberculosis）是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病，主要侵害人體肺部，以活動性肺結核的傳染性最為嚴重。因此，對可能發展為活動性結核病的潛伏感染患者需及時檢出并采取措施，但常規超敏反應皮試試驗、γ 干擾素釋放試驗分析技術（IGRA）均無法有效區分潛伏性感染與活動性結核[27]。對此，Ben Salah E 等[28]利用高分子免疫檢測技術，對IGRA 無法區分的標本進行了高靈敏檢測，結果顯示，基于高分子免疫檢測技術開展的γ 干擾素檢測，其靈敏度是IGRA 技術的100 倍，可進一步鑒別不確定結果中的真陽性與陰性樣本。以上研究說明，利用高分析免疫檢測技術，有助于結核病的鑒別與診斷。

2.2.3 新型冠狀病毒肺炎 新型冠狀病毒肺炎是指2019 新型冠狀病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，其病原物為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）。目前為止，臨床尚無針對SARSCoV-2 特效藥。因此，早期診斷與防控是阻止其傳播的最有效手段[29]。2020 年12 月28 日，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準使用全自動高通量免疫分析儀器Simoa HD-X Analyzer檢測IgG 抗體，其檢測目標為人體針對新冠病毒刺突蛋白區域產生的抗體，通過疑似感染者IgG 抗體的檢測開展COVID-19 診斷。據臨床研究顯示[30]，Simoa 對抗體檢測的敏感性高達100%，特異性為99.2%，由此可見，高分子免疫檢測技術可用于測定疫苗免疫誘導的抗體反應。此外，有研究證實[31]，通過高分子免疫檢測技術檢測免疫調節細胞因子與趨化因子等超敏感蛋白質生物標記物，有望實現COVID-19 的早期高靈敏度診斷，對輕、重癥區分及疾病感染進程的監測均具有重要意義。

2.3 在腫瘤領域中的應用 腫瘤屬于復雜性疾病，根據癌變器官的不同可分為多種亞型，具有較高的致死風險，其早期診斷尤為重要。據Wilson DH 等[32]研究發現，使用單分子陣列檢測技術可有效測量根治性前列腺切除術后患者的血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平，且術后測量最低點PSA，對患者預后情況具有積極預測價值，可減少不必要的輔助放射，有利于復發等情況的及早發現與治療。Shi Y 等[33]基于高分子陣列技術開發了超靈敏定量血液LIF 檢測試劑盒，用于測定胰腺導管腺癌患者的血液LIF 水平，以監測其疾病變化。另有研究應用高分子陣列技術開發了細胞外囊泡免疫測定方法，用于通用細胞外囊泡與腫瘤衍生細胞外囊泡的測定，在腫瘤診斷中更具有積極評估作用。總之，高分子免疫檢測技術對腫瘤標志物診斷具有較高檢測價值，有助于患者預后與治療反應的評估，對復發篩查患者的靶向二級治療提供了良好基礎。除此之外，受到檢測靈敏度的限制，當前臨床使用的腫瘤標志物依然為血液水平較高的普適性標志物，在腫瘤疾病的檢測中，其敏感度及特異性均存在一定限制。在此背景下，高分子免疫檢測在發現新型高特異性標志物方面具有較大潛力。Limor C 等[34]研究顯示，應用單分子陣列技術可對microRNA 進行數字直接檢測，對提高檢測效率及大規模篩選新型靶標具有意義。

3 總結與展望

單分子免疫檢測技術具有超高靈敏度，可充分反映疾病的病理信息與發展進程，在神經退行性疾病、腫瘤、傳染病等疾病的體外診斷中具有廣闊的應用前景，大大推動了相關疾病的早期診斷、治療與藥物開發。近年來，以Simoa 技術為代表的單分子免疫檢測技術已逐步向高靈敏、高通量、自動化等方向發展，其臨床應用也日趨成熟，有望成為重大疾病早期診斷與預后評估的有力工具。但目前為止，單分子檢測技術被正式商業化的產品極少，且均為國外研制，國內則主要停留在實驗室科研層面，其應用發展尚面臨著許多挑戰，有待技術層面與商業化層面的多重優化。