腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Val66Met基因多態(tài)性及氧化應(yīng)激水平與帕金森病震顫癥狀的相關(guān)性研究

曹春華，劉興國(guó)，王安駟

（九江市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 九江 332000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）在65歲以上的老年人中發(fā)病率為1.5%，多由于神經(jīng)退行性病變引起，且老年男性發(fā)病率高于女性[1]。PD臨床表現(xiàn)主要有運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)癥狀和睡眠障礙、感覺(jué)障礙和運(yùn)動(dòng)遲緩等非運(yùn)動(dòng)癥狀，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。已有研究表明，氧化應(yīng)激是PD重要的發(fā)病機(jī)制之一，各種因素導(dǎo)致的體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除不及時(shí)，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)PD[2]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）與諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。研究證實(shí)，BDNF的Val66Met基因多態(tài)性與老年糖尿病患者認(rèn)知功能損害、抑郁癥、阿爾海默茲病密切相關(guān)[3-5]，但Val66Met基因多態(tài)性與PD震顫程度的相關(guān)性國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究擬檢測(cè)PD患者外周血BDNF水平與氧化應(yīng)激標(biāo)記物水平，并探究BDNF Val66Met基因多態(tài)性及氧化應(yīng)激標(biāo)記物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）與PD震顫癥狀評(píng)分的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年10月至2021年3月本院收治的60例PD患者為研究組，另選取同時(shí)期于本院體檢中心60名健康體檢者為對(duì)照組。研究組男36例，女24例；平均年齡（71.49±4.82）歲，平均病程（3.67±0.76）年；對(duì)照組男38名，女22名，平均年齡（71.76±6.43）歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2020年《中國(guó)帕金森病治療指南（第四版）》[1]中PD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡＞18歲，且＜80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腦血管病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；冠心病、糖尿病及高血壓病者；患有特發(fā)性震顫者；患有脊髓疾病及周?chē)窠?jīng)疾病者；存在嚴(yán)重認(rèn)知障礙或溝通困難者。

1.2 方法

1.2.1 BDNF、MDA、SOD、GSH血清水平檢測(cè)抽取患者靜脈血5 ml，分離血清，采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA水平，采用邁瑞B(yǎng)S 350S全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清SOD、GSH水平。

1.2.2 BDNF Val66Met基因多態(tài)性檢測(cè)抽取患者3 ml靜脈血置于抗凝管中，并分離血漿，提取血漿中總DNA。采用Real-time PCR對(duì)BDNF Val66Met基因進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)：5’-AAGAAGCAAACATCCGAGGACA-3’，R：5’-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’，引物由北京華大公司合成。利用PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)擴(kuò)增BDNF Val66Met基因。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，跑膠完成后染色，根據(jù)電泳條帶遷移速率分析BDNF Val66Met基因多態(tài)性。

1.2.3 震顫癥狀評(píng)分根據(jù)帕金森氏病綜合評(píng)分表（unified Parkinson disease rating scaleupdsr，UPDRS）中震顫癥狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)震顫為0分，輕度：輕度震顫或不常發(fā)生為1分；中度：震顫癥狀令人煩惱為2分；重度：震顫癥狀使部分活動(dòng)受限為3分；非常嚴(yán)重：震顫癥狀使大部分活動(dòng)受到影響為4分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Z檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)性分析血清MDA、SOD、GSH水平與震顫評(píng)分的相關(guān)性；Logistic回歸分析血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物與BDNF Val66Met基因多態(tài)性與PD的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物水平比較研究組患者血清MDA水平高于對(duì)照組，SOD及GSH水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組血清MDA、SOD、GSH水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum MDA,SOD and GSH levels between the two groups(±s)

表1 兩組血清MDA、SOD、GSH水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum MDA,SOD and GSH levels between the two groups(±s)

注：MDA，丙二醛；SOD，超氧化物歧化酶；GSH，還原型谷胱甘肽

組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù)60 60 MDA（μmol/L）46.72±4.26 16.33±1.26 52.989＜0.001 SOD（kU/L）72.46±8.28 126.85±9.46-33.512＜0.001 GSH（μmol/L）21.42±2.73 62.92±5.37-53.362＜0.001

2.2 PD患者血清MDA、SOD、GSH水平與震顫評(píng)分的Pearson相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析顯示，研究組患者震顫評(píng)分與MDA水平呈正相關(guān)（r=0.742，P=0.000），與SOD、GSH水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.783、-0.684，P=0.000、0.006）。

2.3 PD患者BDNF Val66Met基因多態(tài)性與震顫癥狀程度的差異性比較研究組攜帶BDNF Val66Met等位基因A患者28例，等位基因G患者32例。等位基因A患者與等位基因G患者震顫癥狀程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 PD患者BDNF Val66Met基因多態(tài)性與震顫癥狀程度的差異性比較Table 2 Comparison of BDNF Val66Met gene polymorphism and degree of tremor symptoms in PD patients

2.4 Logistic回歸分析PD患者BDNF風(fēng)險(xiǎn)等位基因及氧化應(yīng)激標(biāo)記物與震顫程度的影響因素將氧化應(yīng)激指標(biāo)與BDNF風(fēng)險(xiǎn)等位基因A納入多因素Logistic回歸分析模型，變量賦值：MDA、SOD、GSH均采用實(shí)際測(cè)量值，BDNF等位基因A未攜帶=0，BDNF等位基因A攜帶=1。結(jié)果顯示，MDA、SOD、GSH異常表達(dá)及攜帶BDNF等位基因A是加重PD患者震顫癥狀的影響因素，見(jiàn)表3。

表3 Logistic回歸分析PD患者BDNF風(fēng)險(xiǎn)等位基因及氧化應(yīng)激標(biāo)記物與震顫程度的影響因素Table 3 Influencing factors of BDNF risk alleles,oxidative stress markers and tremor degree in PD patients by logistic regression analysis

3 討論

PD對(duì)老年人認(rèn)知功能及運(yùn)動(dòng)功能均會(huì)產(chǎn)生較大程度損傷，但主要影響生命質(zhì)量的是運(yùn)動(dòng)功能。震顫癥狀是PD患者的主要臨床表現(xiàn)，也是影響PD患者運(yùn)動(dòng)功能的主要原因[6-7]。但研究發(fā)現(xiàn)，患者震顫癥狀嚴(yán)重程度各不相同，目前研究尚未完全明確PD患者震顫癥狀表現(xiàn)差異的具體機(jī)制[8-9]。已有研究表明，當(dāng)老年患者體內(nèi)抑制氧化應(yīng)激能力減弱時(shí)，多余的ROS可能通過(guò)破壞中樞神經(jīng)細(xì)胞膜上脂質(zhì)類(lèi)大分子蛋白造成細(xì)胞變性、死亡，引發(fā)震顫癥狀，且可能通過(guò)破壞神經(jīng)細(xì)胞傳到節(jié)點(diǎn)，造成乙酰膽堿傳遞紊亂引發(fā)運(yùn)動(dòng)功能障礙[10-11]。

本研究結(jié)果表明，研究組血清MDA水平高于對(duì)照組，SOD及GSH水平均低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明氧化應(yīng)激確實(shí)與PD發(fā)病相關(guān)。為了證明PD患者氧化應(yīng)激水平與震顫癥狀的相關(guān)性，本研究采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，PD患者震顫評(píng)分與MDA水平呈正相關(guān)，與SOD、GSH水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明氧化應(yīng)激標(biāo)記物的異常表達(dá)與患者臨床癥狀存在內(nèi)部關(guān)聯(lián)。

基因多態(tài)性對(duì)疾病的影響是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，LEE等[12]研究通過(guò)臨床薈萃分析證實(shí)，BDNF 196 AA+AG基因分型在歐洲PD患者中存在易感相關(guān)性，而在亞洲患者中無(wú)明顯相關(guān)。國(guó)內(nèi)對(duì)于PD與基因多態(tài)性的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)Realtime PCR檢測(cè)PD患者BDNF Val66Met基因，再通過(guò)凝膠移動(dòng)速率對(duì)Val66Met基因多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，60例PD患者中，等位基因A攜帶患者28例，等位基因G攜帶患者32例，約占50%，通過(guò)秩和檢驗(yàn)分析證實(shí)，兩種等位基因攜帶患者震顫癥狀程度不同，等位基因A攜帶者震顫癥狀明顯較為嚴(yán)重，Logistic回歸模型進(jìn)一步證實(shí)，氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA、SOD及GSH異常表達(dá)與BDNF等位基因A均為PD患者震顫癥狀嚴(yán)重程度的影響因素。

綜上所述，PD患者震顫癥狀程度可能與氧化應(yīng)激及BDNF Val66Met基因多態(tài)性密切相關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。