雞源凝結芽孢桿菌的篩選鑒定及益生性能評價

代玉明，黃 濤，熊 濤

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330031)

益生菌是指達到一定數量能夠對機體發揮益生作用的活體微生物，其中乳酸菌因具有優良的益生性能而在食品等諸多行業被廣泛使用和研究[1]，但常見的乳酸菌如雙歧桿菌、乳酸乳球菌等抗逆性差，在生產、運輸和使用過程中容易出現效用下降的問題，所以益生性能優良且抗逆性強的乳酸菌菌種篩選是食品等行業需要長期關注和研究的課題。

近年來,“產芽孢的乳酸菌”——凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)憑借較高的抗逆性受到市場的青睞，且于2016年被衛健委列入《可用于食品的菌種名單》。凝結芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，端生或中生芽孢，能夠利用葡萄糖、甘露醇等多種糖類生成乳酸，且產芽孢的特點賦予凝結芽孢桿菌對惡劣環境極強的抗逆性，如高溫、強酸、高膽鹽等[2]；凝結芽孢桿菌主要來源于動物糞便、土壤和傳統發酵食品等。凝結芽孢桿菌不僅有傳統乳酸菌調節腸道菌群、提高免疫力、抗氧化和降低膽固醇的能力[3-4]，而且具有儲存運輸穩定、不易染菌、易于培養等特點。目前，凝結芽孢桿菌制劑在食品工業、醫療、養殖業等行業普遍應用[5]。

篩選性能優良的凝結芽孢桿菌是其保證其產品質量的前提之一，所以對菌種的評價尤為重要。日前多數研究凝結芽孢桿菌的評價是多樣化的，主要包括凝結芽孢桿菌生產和使用過程中對各種環境的耐受能力、特殊代謝產物的生產和代謝能力及其發酵產品對宿主腸道菌群的影響等[6]，對于凝結芽孢桿菌自身的膽固醇降解活性及抗氧化性方面研究較少。有研究表明,益生菌對膽固醇有一定的降解能力[7]，也可作為生物抗氧化劑，通過調節差異表達的蛋白質改變磷酸甘油激酶等多種酶類的表達水平以增強抗氧化活性[8-9]。由于益生菌的評價指標較復雜且有菌株特異性，很難進行綜合對比，而有研究表明主成分分析法可以在損失較少原有信息的基礎上巧妙地規避重復性數據的影響比較綜合性能的強弱[10-11]。

本研究旨在從蘆花雞糞便中篩選并鑒定出凝結芽孢桿菌，針對芽孢桿菌的特性，評價其耐熱能力和胃腸道耐受性，通過主成分分析法綜合比較凝結芽孢桿菌抗逆性能，再通過比較菌株的產酸能力、膽固醇降解能力、抗氧化能力及安全性，獲得既安全又具備較強益生性能的凝結芽孢桿菌，豐富現有菌種資源，為凝結芽孢桿菌在產業化的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

蘆花雞糞便：取樣自江西省南昌市郊花鳥市場。

1.2 培養基與試劑

MRS培養基：細菌學蛋白胨10 g，牛肉膏5.2 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三胺2 g，吐溫801 mL，磷酸氫二鉀0.116 g，硫酸鎂0.01 g，一水合硫酸錳0.004 g，無水乙酸鈉0.3 g，蒸餾水1 L。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L。

模擬胃液：PBS緩沖液，胃蛋白酶3.0 g·L-1，稀鹽酸調節pH為2.0～3.0。

模擬腸液：PBS緩沖液(pH調至8.0)，胰蛋白酶1.0 g·L-1，牛膽鹽為0.1%～0.5%。

標準對照菌株：凝結芽孢桿菌ATCC? 7050TM:上海寶錄生物科技有限公司。

試劑盒：羥自由基測定試劑盒、DPPH自由基測定試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)：南京建成生物工程研究所；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒：生工生物(上海)股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 凝結芽孢桿菌篩選

將樣品稀釋液經80 ℃水浴處理15 min，冰浴至常溫，稀釋涂布于含0.4%溴甲酚紫的MRS培養基，40 ℃孵育48 h，根據菌落形態及變色圈挑取單菌落進行分離純化。觀察菌落的大小、邊緣形狀、顏色、平滑度等特點，并進行革蘭氏染色鏡檢觀察。

1.3.2 菌株鑒定

1.3.2.1 生理生化鑒定

參考《伯杰細菌鑒定手冊》對菌株進行生理生化實驗見表1。

表1 生理生化實驗Table.1 Physiological and biochemical experiment

1.3.2.2 分子生物學鑒定

按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒說明書提取DNA。選取上游引物為27 F，下游引物為1492R；并設置PCR反應程序為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，4 ℃保存，對目的片段16S rDNA進行擴增及對目的片段進行電泳檢測，PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序及比對分析。

1.3.3 種子液及待測樣品制備

將已鑒定的22株凝結芽孢桿菌及標準對照菌株ATCC7050的單菌落接至MRS培養基中，40 ℃培養24 h，按4%的接種量在MRS培養基中活化兩代，通過MRS培養基稀釋后使得其菌濃為1×108CFU·mL-1，并將其作為種子液。按4%的接種量將種子液接種于LB培養基中40℃孵育48h，此時菌株處于穩定期，離心沉淀后通過生理鹽水等體積重懸，稀釋使其最終活菌數為1×108CFU·mL-1，并將其作為待測樣品。

1.3.4 凝結芽孢桿菌抗逆性

1.3.4.1 凝結芽孢桿菌耐熱性能及模擬胃腸液耐受性

待測樣品在70 ℃，80 ℃和90 ℃水浴中處理5，10，15 min，以標準菌株ATCC7050處理組作為對照，探究凝結芽孢桿菌對高溫的耐受性。

待測樣品在pH2.0，2.5和3.0的模擬胃液下37 ℃處理3 h，以及在膽鹽濃度為0.1%，0.3%，0.5%的模擬腸液中37 ℃處理4 h，以標準菌株ATCC7050處理組作為對照，探究凝結芽孢桿菌在模擬胃腸液中的耐受性。

樣品處理后進行稀釋涂布計算活菌數，存活率計算如下：

Nn：樣品處理后的活菌數，CFU·mL-1；No：樣品處理前的活菌數，CFU·mL-1

1.3.4.2 主成分分析

將凝結芽孢桿菌抗逆性數據進行主成分分析，通過KOM和巴特利特球形度檢驗判斷主成分分析的可行性。根據總方差解釋得到主成分見表2，經IBM SPSS Statistics23處理得到主成分的線性組合，按主成分的得分方差所占比例得到總得分，通過總得分比較凝結芽孢桿菌的綜合耐受性。

1.3.5 產乳酸性能

采用高效液相色譜法(HPLC)測定產乳酸性能(1260，Agilent，USA)。按4%的接種量將種子液接種于MRS培養基，40 ℃孵育24 h，菌懸液10 000×g離心10 min取上清，同時梯度稀釋乳酸標準品制作標準曲線，將上清液及標準品通過0.22 μm濾膜過濾上機測定，根據乳酸標準曲線計算樣品中乳酸含量。

1.3.6 膽固醇降解活性

按4%的接種量將種子液接種于含50 μg·mL-1膽固醇(溶劑為乙醇)的MRS液體培養基中，40 ℃孵育24 h，按照鄰苯二甲醛法[12]計算膽固醇去除率，公式如下：

Co：孵育前膽固醇含量，μg；Cn：孵育后膽固醇含量，μg

1.3.7 抗氧化性能

按4%的接種量將種子液接種于MRS培養基，40 ℃孵育24 h得到待測菌液，此時待測菌液處于穩定期。羥自由基清除性能、DPPH自由基清除性能和總抗氧化活性按試劑盒說明書進行操作。

1.3.8 安全性評價

將種子液接種于哥倫比亞血瓊脂平板確定菌株溶血性，以金黃色葡萄球菌CMCC26003作為對照。將種子液涂布于MRS平板并放置藥敏紙片，在40 ℃下培養24 h后，測量其抑菌直徑評價藥物敏感性，10種常用藥敏紙片種類見表4。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定結果

從雞糞便中分離鑒定得到22株凝結芽孢桿菌，菌落表面略顯粗糙，呈顆粒狀，有光澤且不透明，邊緣較規則，中心凸起，菌落較大，符合凝結芽孢桿菌的形態特征。所得菌株的革蘭氏染色如圖1～3所示，生理生化鑒定結果如表1所示，符合凝結芽孢桿菌的生理生化特征。經分子生物學鑒定可知初篩得到的22株菌可確定為凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，菌株NCUBCG003、NCUBCG004及NCUBCG014的系統發育樹如圖4所示，其分子生物學鑒定結果見附件1。

圖1 凝結芽孢桿菌NCUBCG004的菌體形態(1000×)Fig.1 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG004(1000×)

圖2 凝結芽孢桿菌NCUBCG014的菌體形態(1000×)Fig.2 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG014(1000×)

圖3 凝結芽孢桿菌NCUBCG003的菌體形態(1000×)Fig.3 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG003(1000×)

圖4 凝結芽孢桿菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus coagulans NCUBCG003,NCUBCG004 and NCUBCG014

2.2 凝結芽孢桿菌抗逆性

2.2.1 耐熱性能

芽孢桿菌菌劑的工業化生產通常采用噴霧干燥的方法，噴霧干燥中所產生的70 ℃～90 ℃的高溫要求芽孢桿菌有較高的耐高溫能力，因此耐高溫性能是篩選優良芽孢桿菌的重要指標之一[13]。

如圖5所示，22株凝結芽孢桿菌除NCUBCG016外經90 ℃處理后存活率均在60.0%以上，部分菌株存活率隨溫度升高而降低。菌株ATCC7050、NCUBCG014、NCUBCG001、NCUBCG002、NCUBCG009、NCUBCG017在不同溫度處理后存活率穩定，達90.0%；特別是NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG007在90℃處理后存活率高達95.0%以上。有研究表明，凝結芽孢桿菌均具備一定的耐熱性，凝結芽孢桿菌ATCC8038在pH為4.0的番茄汁中，經95 ℃高溫處理20 min后其活菌數僅降低1 log·CFU·mL-1[14]。在經80 ℃處理10 min后凝結芽孢桿菌的存活率普遍降低，可能是溫度和萌發培養基不能完全刺激芽孢萌發；有研究表明經70 ℃～80 ℃處理后凝結芽孢桿菌營養體已死亡，且在此溫度下芽孢萌發率較低，同時芽孢萌發需要受體蛋白的作用，不同的營養劑對受體蛋白的促進具有特異性[15]。綜合以上分析可知，凝結芽孢桿菌對高溫均有一定的耐受性，尤其是菌株NCUBCG014、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG006和NCUBCG007等能夠在工業化生產過程中保持較高的存活率。

處理組圖5 凝結芽孢桿菌耐熱性能Fig.5 Heat resistance of Bacillus coagulans

2.2.2 模擬胃腸液耐受性

如圖6所示，經pH=2.0的模擬胃液處理后，大部分菌株存活率較低，菌株的存活率隨pH值的升高而升高，經pH=3.0的模擬胃液處理后多數菌株存活率可達95.0%以上，菌株NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG007、NCUBCG014經pH=2.0胃液處理后存活率仍達85.0%以上。有研究表明，通常情況下人體胃酸pH約為2.0～3.0，動物胃液略高，在食物未消化完全的情況下胃部pH可達3.0以上[16]。

圖6 凝結芽孢桿菌模擬胃腸液耐受性Fig.6 Tolerance of Bacillus coagulans to simulated gastrointestinal fluid

所有菌株在不同膽鹽濃度的模擬腸液處理后存活率均在66.20%以上，隨著膽鹽濃度升高，多數菌株存活率降低；但菌株NUCBCG004和NUCBCG014經0.5%的膽鹽處理后存活率高達99.0%以上，而NCUBCG003和NCUBCG002耐膽鹽能力稍差，其存活率仍可達90.0%以上。另一方面，菌株NCUBCG012經高濃度膽鹽比低濃度膽鹽處理后存活率高，有研究表明高膽鹽中鈉鹽和鉀鹽可能會促進芽孢的生成[17]；NCUBCG023等菌株經膽鹽處理后存活率較低，多項研究表明菌株的耐膽鹽能力較弱可能與膽鹽水解酶不足有關[18]。

標準菌株ATCC7050相比于其他凝結芽孢桿菌在模擬胃腸液環境下能夠穩定地保持較高的活性，存活率約為90%。有報道對凝結芽孢桿菌MTCC5856等標準株的體外模擬胃腸液耐受性進行分析，研究發現這些標準菌株對模擬胃腸液等惡劣環境具備較強的抗逆性，在食品等領域體現出極高的應用價值[19]。綜合分析可知本研究所篩選的大多數凝結芽孢桿菌能夠在其他食物存在的情況下，在胃部保持較高的活性，同時對膽鹽環境也有一定的耐受性，而菌株NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014對胃腸道環境有極高的耐受性，能夠在胃腸道環境下維持較高的活性，發揮其益生作用。

2.2.3 主成分分析結果

2.2.3.1 適用性檢驗與成分提取結果

經計算KMO取樣適切性量數為0.681(>0.6)，巴特利特球形度檢驗的顯著性為0.000(<0.05)，兩種檢驗結果都說明了凝結芽孢桿菌抗逆性指標間存在相關性，適用于主成分分析法[20-21]。

如表2所示，共提取3種主成分并命名為Z1、Z2、Z3，可解釋總方差的78.03%，即可以通過3種主成分的綜合得分在權重為78.03%的基礎上評價菌種抗逆性(耐熱能力和胃腸道耐受性)。

表2 各成分總方差解釋Table.2 Interpretation of total variance of each component

2.2.3.2 主成分計算及得分結果

由表3可知，菌種NCUBCG004、NCUBCG003、NUCBCG014綜合得分排名前三，而ATCC7050綜合得分在第五位，說明相比于標準菌株以及其他凝結芽孢桿菌，這3株菌在耐熱和胃腸道耐受性的綜合性能上表現最為優良，對惡劣環境的抗逆性最強。

2.2.3 產乳酸性能

經測定乳酸標準曲線為y=0.2862x-13.398,R2為0.9999，可用于乳酸含量測定。

表3 凝結芽孢桿菌各主成分得分及綜合得分Table.3 Main component scores and comprehensive scores of Bacillus coagulans

由圖7可知，菌株NCUBCG007、NCUBCG008的乳酸產量不足1.0 g·L-1，可能是由于本研究所用MRS培養基影響了糖酵解、糖異生和三羧酸循環等途徑，與產乳酸相關的酶促反應速度下降，使得乳酸含量較低[22]；其次菌株之間的差異也是造成其乳酸產量不同的原因之一。而菌株NCUBCG012、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014的乳酸產量相比于其他凝結芽孢桿菌較高，可達5.0 g·L-1以上，標準菌株ATCC7050產乳酸能力最高，達8.83 g·L-1，有利于在宿主體內發揮抑菌、調節腸道菌群結構等作用。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖7 凝結芽孢桿菌產乳酸能力Fig.7 Lactic acid content of Bacillus coagulans

2.2.4 膽固醇降解能力

如圖8所示，凝結芽孢桿菌膽固醇去除率均在25.0%以上，NCUBCG008、NCUBCG006、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014五株凝結芽孢桿菌的膽固醇去除率可達50.0%以上；而標準對照菌株ATCC7050的膽固醇去除率僅為35.71%，同時菌株NCUBCG012、NCUBCG017和NCUBCG023的膽固醇去除率也相對較低，只有25.0%左右。有體外研究表明，益生菌有一定的降解膽固醇的能力，受菌株差異、生長階段等因素的影響，膽固醇去除率不盡相同，凝結芽孢桿菌MTCC5856的膽固醇去除率最高可達48.42%[23]。由此可見，凝結芽孢桿菌NCUBCG008、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014和NCUBCG006的膽固醇降解能力相對較高。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖8 凝結芽孢桿菌膽固醇去除率Fig.8 Cholesterol degradation rate of Bacillus coagulans

2.2.5 抗氧化活性

2.2.5.1 羥自由基清除能力測定結果

定義：規定每毫升的菌液在37 ℃下反應1min，使反應體系中H2O2濃度降低1 mmol·L-1為一個抑制羥自由基能力單位。

據圖9可知，凝結芽孢桿菌的羥自由基清除能力均在50.0 U·mL-1以上，菌株差異不大，以標準株ATCC7050的羥基自由基清除能力最弱，達52.44 U·mL-1，而菌株NCUBCG002、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014高達60.0 U·mL-1以上，羥自由基清除能力最強。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖9 凝結芽孢桿菌羥自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of Bacillus coagulans

2.2.5.2 DPPH自由基清除能力測定結果

DPPH自由基的清除能力主要靠菌液中抗氧化劑的供氫能力決定的，不同的菌株對多肽等抗氧化劑的代謝能力上也有所不同。據圖10可得,凝結芽孢桿菌的DPPH自由基清除率在60%以上，其中NCUBCG007和NCUBCG0018則較低，特別是標準菌株ATCC7050地DPPH自由基的清除率最低，只有62.64%；有研究表明，凝結芽孢桿菌具備潛在的抗氧化性能，菌株T242的DPPH自由基清除率僅有35.0%[24]。而菌株NUCBCG003、NCUBCG004、NCUBCG006和NCUBCG014的DPPH自由基清除率最高，可達75%以上。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖10 DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH free radical scavenging capacity of Bacillus coagulans

2.2.5.3 總抗氧化性能測定結果

據圖11中所示，本文所研究的凝結芽孢桿菌總抗氧化性能均可相當于1 mmol·L-1以上的FeSO4溶液，菌株NCUBCG002、NCUBCG08、NCUBCG016和NCUBCG025總抗氧化性能較弱，標準菌株ATCC7050的總抗氧化能力也僅相當于2.24 mmol·L-1的FeSO4溶液；而不同的是，菌株NCUBCG001、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014和NCUBCG017的總抗氧化能力相對較強，尤其是NCUBCG014的總抗氧化能力相當于3.5 mmol·L-1的FeSO4溶液。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖11 總抗氧化能力(FRAP)Fig.11 Total antioxidant capacity of Bacillus coagulans (FRAP)

2.6 安全性評價

如表4所示，標準株ATCC7050、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014均為γ溶血，而陽性對照株金黃色葡萄球菌CMCC26003表現出β溶血性(出現透明溶血環)，表明這3株凝結芽孢桿菌均無溶血活性；且抗生素敏感性測定結果可表明凝結芽孢桿菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014對常見的10種抗生素均敏感，因此可以說明這3株凝結芽孢桿菌為安全菌種[25]。

表4 凝結芽孢桿菌抗生素敏感性與溶血活性Table.4 Antibiotic sensitivity and hemolytic activity of Bacillus coagulans

3 結論

本文研究通過熱脅迫處理從蘆花雞糞便分離鑒定出22株凝結芽孢桿菌，分析了凝結芽孢桿菌耐熱性能及胃腸道耐受性，并通過主成分分析法綜合比較凝結芽孢桿菌抗逆性，同時評價22株凝結芽孢桿菌的產乳酸能力、膽固醇降解能力以及抗氧化活性。實驗結果表明菌株NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014在抗逆性及乳酸菌常見益生性能上均優于其他凝結芽孢桿菌，且體外安全性評價表明NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014為安全菌種。綜合以上分析可知，凝結芽孢桿菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014在所評價的各項基礎益生性能上表現為潛在優良的菌株，具備在人和動物體內發揮益生作用的潛能，能夠豐富微生物優良菌種資源，為凝結芽孢桿菌產業化應用和發展提供動力，同時本文評價方法可為益生菌性能評價提供參考。