乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛活性成分與抗氧化功能動(dòng)態(tài)分析

黃 慶，林華嗣，王國(guó)鑫，胡曉波

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西九草鐵皮石斛科技協(xié)同創(chuàng)新有限公司，江西 鷹潭 335000)

鐵皮石斛是一種蘭科石斛屬草本植物，主要分布于我國(guó)云南、廣西、貴州、浙江、江西等地的山區(qū)[1]，并享有“救命仙草”的美譽(yù)。許多研究表明，鐵皮石斛含有多糖、礦物質(zhì)、氨基酸、石斛堿、多酚、黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分[1-3]，具有降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種活性功能。鐵皮石斛作為一種食藥同源品種，主要被加工成鐵皮楓斗，或浸酒、燉湯。隨著人工種植技術(shù)的突破，鐵皮石斛的產(chǎn)量不斷增加，如何對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行現(xiàn)代化加工成為迫切需要解決的問(wèn)題。

發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的食品加工方法，通過(guò)微生物的作用可降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，生成生物活性物質(zhì)，增加活性成分的生物利用度[4,5]。例如，酵母菌發(fā)酵鐵皮石斛水提液能降低多糖的分子量，提高石斛發(fā)酵液的生理活性[6]。通過(guò)發(fā)酵得到的鐵皮石斛多糖具有良好的自由基清除能力，以及出色的金屬螯合活性[7]。在芒果皮的發(fā)酵中，乳酸菌作為活性發(fā)酵劑能提高發(fā)酵液中的總酚含量[8]。王丹等[9]研究發(fā)現(xiàn)采用乳酸菌、霉菌等不同菌種發(fā)酵鐵皮石斛粗多糖水提液，能提高其抗氧化活性和降血糖活性。有研究發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵通過(guò)多菌種協(xié)同發(fā)酵作用，使發(fā)酵液具有更豐富的風(fēng)味和柔和的口感，含更多的活性功能成分，同時(shí)還可以使產(chǎn)品保持較高的貯藏品質(zhì)[10]。

鐵皮石斛為開(kāi)發(fā)健康食品提供了良好的來(lái)源，如鐵皮石斛酸奶[11]、鐵皮石斛紅棗復(fù)合功能性果汁[12]等。實(shí)驗(yàn)以鐵皮石斛鮮條為原料，乳酸菌為發(fā)酵菌種，對(duì)鐵皮石斛汁發(fā)酵過(guò)程中的活性成分以及抗氧化能力進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。目的在于分析乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)鐵皮石斛品質(zhì)的影響以及了解鐵皮石斛乳酸菌發(fā)酵飲品的潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為開(kāi)發(fā)高活性乳酸菌飲料提供一定的可行性分析和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：江西軒斛生物科技有限公司提供。

植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌：山東中科嘉億生物工程有限公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、福林酚、沒(méi)食子酸、瓊脂購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、水楊酸購(gòu)自阿拉丁；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司)，其他藥品試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ雙人凈化工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PHS-2F型數(shù)字pH計(jì)，上海精密儀器有限公司；ZQTY-70E振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；BSP-100生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1810DAPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；TGL216G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JS-THERMO多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的活化

將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌接種于100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后進(jìn)行二次傳代，菌種充分活化后的種子菌液放4 ℃冰箱保存。

1.3.2 鐵皮石斛發(fā)酵原液的制備

將洗凈的鐵皮石斛切斷，沸水滅酶2～3 min，將燙漂好的鐵皮石斛段與蒸餾水按照料液比1:10打汁，置于250 mL無(wú)菌錐形瓶85 ℃，20 min滅菌。

1.3.3 接種與發(fā)酵

選擇植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌(植+嗜)，植物乳桿菌+副干酪乳桿菌(植+副)，嗜酸乳桿菌+副干酪乳桿菌(嗜+副)3種混菌發(fā)酵以1:1的比例接種2%(v/v)的活化菌液，在37 ℃恒溫發(fā)酵72 h。發(fā)酵過(guò)程中在12，24，36，48，72 h進(jìn)行取樣，于4 ℃冰箱保存。

1.3.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.4.1 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

根據(jù)GB4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 pH的測(cè)定

使用pH計(jì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.3 總糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[13]進(jìn)行測(cè)定，略有改動(dòng)。取25 μL發(fā)酵液至25 mL具塞試管中用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，在通風(fēng)櫥中依次加入5%苯酚試劑1 mL，濃硫酸5 mL，混合均勻，沸水浴20 min后立刻冰水浴5 min，488 nm處測(cè)量吸光值。線性回歸方程：y=48.75x+03557，R2=0.9994。

1.3.4.4 總酚含量的測(cè)定

采用福林酚法[14]進(jìn)行測(cè)定，略有改動(dòng)。取0.8 mL發(fā)酵液至25 mL具塞試管中，依次加入0.3 mL福林酚試劑，1.5 mL 7%碳酸鈉溶液后用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL，避光反應(yīng)20 min后測(cè)量760 nm處的吸光度。線性回歸方程：y=0.0986x+00606，R2=0.9995。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]并加以改進(jìn)，取100 μL的發(fā)酵液，100 μL,0.1 mmol·L-1的DPPH-95%乙醇溶液加入96孔板中，37 ℃避光反應(yīng)30 min，用去離子水做參比，在517 nm下測(cè)定吸光值。空白組將去離子水替代發(fā)酵液，對(duì)照組將95%乙醇替代DPPH-95%乙醇溶液。

1.3.5.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]并加以改進(jìn)，向96孔板依次加入9 mmol·L-1FeSO450 μL，9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液30 μL，發(fā)酵液20 μL，8.8 mmol·L-1H2O240 μL和50 μL去離子水，充分混勻，37 ℃避光反應(yīng)15 min，510 nm處測(cè)定吸光值，用去離子水做參比。空白組將去離子水替代發(fā)酵液，對(duì)照組用無(wú)水乙醇替代水楊酸-乙醇溶液。

1.3.5.3 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]并加以改進(jìn)，取5 mL、7 mmol·L-1的ABTS溶液，加入88 μL 140 mmol·L-1的過(guò)硫酸鉀溶液混合均勻，室溫下過(guò)夜避光反應(yīng)，得到ABTS工作母液。用去離子水對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專蛊湓?34 nm處的吸光值為0.7±0.02，得到最終的ABTS工作液。取30 μL發(fā)酵液，200 μL ABTS工作液加入到96孔板中充分混勻后37 ℃避光反應(yīng)6 min，在734 nm下測(cè)得吸光值。空白組將去離子水替代發(fā)酵液，對(duì)照組用去離子水替代ABTS工作液。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中活菌數(shù)的變化

由圖1可知，3種乳酸菌混菌發(fā)酵液的活菌數(shù)有相同的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵前期均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的滯后期，說(shuō)明鐵皮石斛是乳酸菌生長(zhǎng)繁殖的良好底物。在發(fā)酵前中期活菌數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)性增長(zhǎng)，并在24 h處達(dá)到最大值8.72 lg(CFU/mL)，隨后發(fā)酵進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)出現(xiàn)不同程度的下降并最終保持穩(wěn)定。在紅甜菜和枸杞汁的研究中乳酸菌活菌數(shù)也有相同的變化過(guò)程[18,19]。發(fā)酵進(jìn)入衰亡期的原因主要與發(fā)酵基質(zhì)以及發(fā)酵環(huán)境有關(guān)，未額外添加碳源會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，pH的不斷下降也制約著乳酸菌的繁殖[20]。在整個(gè)發(fā)酵周期中，3種混菌發(fā)酵液的活菌數(shù)均能達(dá)到8.00 lg(CFU/mL)，顯著高于起始值，且直到發(fā)酵終點(diǎn)仍保留有7.00 lg(CFU/mL)的活菌數(shù)目，能發(fā)揮一定的益生作用。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖1 鐵皮石斛發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化Fig.1 Change of viable bacteria count during dendrobium officinale fermentation

2.2 發(fā)酵過(guò)程中pH的變化

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液的pH值呈現(xiàn)出不斷下降的變化，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中乳酸菌產(chǎn)生了各種有機(jī)酸，比如檸檬酸、蘋果酸和乳酸等[21]。結(jié)果顯示pH在乳酸菌的指數(shù)生長(zhǎng)期快速下降，說(shuō)明產(chǎn)酸能力強(qiáng)，這與前人的研究一致[22]。在發(fā)酵過(guò)程中，植+嗜的pH下降速率低于其他兩組，造成結(jié)果的原因可能是乳酸菌產(chǎn)酸能力的差異，每一種乳酸菌都有不同的代謝酶系，有機(jī)酸的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化主要與乳酸菌的糖酵解代謝和半乳糖代謝途徑有關(guān)[23]。與發(fā)酵初始值相比，發(fā)酵后的pH顯著下降，最低可達(dá)3.15。試驗(yàn)選擇的乳酸菌在鐵皮石斛汁中都能發(fā)揮較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖2 鐵皮石斛發(fā)酵過(guò)程中pH的變化Fig 2 Change of pH during Dendrobium officinale fermentation

2.3 發(fā)酵過(guò)程中活性成分的變化

2.3.1 總糖含量的變化

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加總糖含量不斷下降。在整個(gè)發(fā)酵周期總糖含量整體上是呈下降趨勢(shì)的，在發(fā)酵后期趨于平緩。發(fā)酵72 h后發(fā)酵液(植+嗜)和發(fā)酵液(植+副)總糖含量分別降低了42.31%和40.72%，而發(fā)酵液(嗜+副)只降低了24.89%。下降的原因是隨著乳酸菌的不斷增長(zhǎng)，發(fā)酵液中的糖類被微生物利用[5]。從結(jié)果可以看出，3種混菌發(fā)酵對(duì)總糖的影響程度各不相同，這是因?yàn)椴煌木胁煌拇x途徑。多糖含量是鐵皮石斛功能活性的考察指標(biāo)之一，在發(fā)酵過(guò)程中可以嘗試通過(guò)補(bǔ)加碳源作為底物，以抑制多糖含量的降低。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖3 鐵皮石斛發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化Fig 3 Change of total sugar content in Dendrobium officinale during fermentation

2.3.2 總酚含量的變化

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，鐵皮石斛發(fā)酵樣液中的總酚含量不斷增加，在24 h處達(dá)到最大值，分別達(dá)到34.00(植+嗜)，34.32(植+副)，35.32 mg·L-1(嗜+副)，隨后開(kāi)始下降，發(fā)酵結(jié)束總酚含量仍然高于未發(fā)酵的鐵皮石斛汁。由此可見(jiàn)，乳酸菌發(fā)酵能明顯提高鐵皮石斛汁中的總酚含量。其原因可能是乳酸菌在代謝過(guò)程中通過(guò)解聚或者相關(guān)酶的作用影響著多酚類物質(zhì)含量[24,25]。在發(fā)酵后期，總酚不斷下降可能的原因是乳酸菌進(jìn)入衰亡期，代謝活動(dòng)減弱導(dǎo)致多酚的增加量減少，以及與一些大分子物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生沉淀以及被氧化，導(dǎo)致多酚物質(zhì)的損失[9]。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖4 鐵皮石斛發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig 4 Change of total phenolic content in Dendrobium officinale during fermentation

2.4 發(fā)酵過(guò)程中抗氧化能力的變化

2.4.1 DPPH自由基清除能力的變化

由圖5可知，經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵可以顯著提高鐵皮石斛汁的DPPH自由基清除能力，在0～72 h過(guò)程中發(fā)酵液的清除能力總體呈現(xiàn)先增加后保持穩(wěn)定或略有下降。植+嗜、植+副、嗜+副發(fā)酵液分別在48，36和24 h達(dá)到最大值，其中嗜+副對(duì)DPPH自由基的清除能力在發(fā)酵24 h處達(dá)62.84%，比發(fā)酵前提高了90.60%。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖5 鐵皮石斛發(fā)酵液DPPH自由基清除能力Fig 5 DPPH free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

不同的菌有不同的發(fā)酵特性，從而導(dǎo)致最佳的發(fā)酵時(shí)間清除能力有所不同。研究表明DPPH自由基的清除能力與咖啡酸、蘆丁和肉桂酸的含量呈顯著正相關(guān)[26]。乳酸菌發(fā)酵提高了鐵皮石斛發(fā)酵液的多酚，可能是其清除DPPH自由基能力提高的原因之一；但同時(shí)活性多糖含量、分子量下降[27]也會(huì)影響其抗氧化效果，所以活性多糖含量和分子量的變化對(duì)其抗氧化能力的影響，還需深入研究。

2.4.2 羥基自由基清除能力的變化

由圖6可知，乳酸菌發(fā)酵能提高鐵皮石斛汁的羥基自由基清除能力，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中其變化趨勢(shì)與DPPH自由基清除能力類似。發(fā)酵樣液植+副和嗜+副在24 h處達(dá)到最大值分別為64.24%和68.21%，而植+嗜在36 h達(dá)到最大值66.22%，其中增幅最高的是嗜+副32.73%。不同發(fā)酵液的羥基自由基清除能力不同，自由基的清除能力不僅僅與多酚含量有關(guān)，可能還與多酚的組成不同有關(guān)[28]。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖6 鐵皮石斛發(fā)酵液羥基自由基清除能力Fig 6 Hydroxyl free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

2.4.3 ABTS自由基清除能力的變化

由圖7可知，鐵皮石斛發(fā)酵液的ABTS自由基清除能力變化情況與DPPH自由基和羥基自由基相似，其中增幅最高可達(dá)41.42%(植+副)。同樣的ABTS自由基清除能力的提高可能和多酚有關(guān)，相關(guān)研究中得出發(fā)酵后的多酚提取物能顯著提高ABTS自由基的清除率[29]。3種混菌對(duì)自由基清除的影響具有顯著性差異，這可能是發(fā)酵液中多酚組成的影響，以及每種多酚化合物對(duì)自由基清除能力的貢獻(xiàn)具有差異性[30]。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖7 鐵皮石斛發(fā)酵液ABTS自由基清除能力Fig 7 ABTS free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

2.5 發(fā)酵鐵皮石斛汁活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析

由表1可知，發(fā)酵液(植+副)的總酚含量與羥基自由基清除率和ABTS自由基清除率呈顯著正相關(guān)性，發(fā)酵液(嗜+副)的總酚含量與羥基自由基清除率呈顯著正相關(guān)性(p<0.05)；發(fā)酵液(植+副)的總糖含量與DPPH自由基清除率呈極顯著負(fù)相關(guān)性(p<0.05)，(嗜+副)的總糖含量與ABTS自由基清除率呈顯著負(fù)相關(guān)性，其他自由基清除率與總糖含量無(wú)明顯相關(guān)性。有研究[31]發(fā)現(xiàn)抗氧化活性主要與酚酸和黃酮含量密切相關(guān)；黃凱偉等[32]的研究推測(cè)多糖含量與抗氧化活性無(wú)相關(guān)性的原因是由于鐵皮石斛水溶性多糖抗氧化活性差造成的。從相關(guān)性分析結(jié)果來(lái)看酚類物質(zhì)在提高發(fā)酵液抗氧化能力中起重要作用。

表1 發(fā)酵液活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析Tab 1 Correlation analysis between active components and antioxidant capacity

3 結(jié)論與討論

研究采用3個(gè)混菌組發(fā)酵鐵皮石斛汁，結(jié)果表明3個(gè)混菌組中的乳酸菌均能在鐵皮石斛汁中良好生長(zhǎng)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中(0～72 h)，pH下降明顯；總糖含量呈現(xiàn)不同的下降趨勢(shì)，其中嗜+副的總糖消耗最少；同時(shí)，嗜+副發(fā)酵后活菌數(shù)、總酚、對(duì)DPPH自由基的清除能力和羥基自由基的清除能力提高最多。后續(xù)試驗(yàn)可以通過(guò)額外添加碳源，減少乳酸菌對(duì)總糖的消耗，提高乳酸菌的生物轉(zhuǎn)化效率，進(jìn)一步提升鐵皮石斛的開(kāi)發(fā)品質(zhì)。

在體外抗氧化能力中，發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除能力的增幅要高于羥基自由基清除能力和ABTS自由基清除能力，不同的混菌發(fā)酵有不同的提升效果，且最佳發(fā)酵時(shí)間也各不相同。經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵，鐵皮石斛汁的抗氧化能力有不同程度的增大，可能與多酚類物質(zhì)的增加和組成有關(guān)；有研究表明乳酸菌發(fā)酵將大分子多糖轉(zhuǎn)化成活性更強(qiáng)的小分子多糖也可能提高其抗氧化能力，乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖也具有一定程度的抗氧化活性。發(fā)酵過(guò)程中，活性多糖和多酚對(duì)其抗氧化能力的影響，還需深入研究。

綜上所述，3種乳酸菌混菌發(fā)酵均能在不同程度上改善鐵皮石斛汁的品質(zhì)，不同的混菌發(fā)酵有不同的最佳發(fā)酵時(shí)間，且發(fā)酵12～36 h是比較適宜的。乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛不僅能顯著改善鐵皮石斛汁的品質(zhì)，也賦予鐵皮石斛汁獨(dú)特的功能活性。此外，由于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程沒(méi)有使用食品添加劑，試驗(yàn)可為開(kāi)發(fā)鐵皮石斛乳酸菌發(fā)酵清潔標(biāo)簽食品提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。發(fā)酵可作為增強(qiáng)鐵皮石斛功能和開(kāi)發(fā)鐵皮石斛健康品的重要手段之一。