基于UPLC-QTOF-MS技術探究黃龍病臍橙與正常臍橙的成分差異

楊天銘，劉渝辰，梁 露，甘思逸，劉宇鑫，王遠興

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

臍橙營養豐富，含有精油，類黃酮、類胡蘿卜素、酚酸、檸檬苦素以及維生素等多種有益化學成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗突變，降膽固醇水平及調節免疫力等生理功效[1]。臍橙CitrussinensisOsbeck被稱為“柑橘之王”，主要盛產于江西、重慶、廣西、湖南、四川等地。其外表鮮美、香味濃郁、口感酸甜，屬于水果中的佳品。但由于臍橙園中果樹品種通常較為單一，容易受到病蟲害的威脅，黃龍病(Huanglongbing，HLB)又稱黃梢病、青果病、黃枯病，是由一種由于柑橘韌皮部定殖細菌CandidatusLiberibacter asiaticus(CLas)引起的柑橘免疫疾病[2]，柑橘黃龍病的傳播途徑一般分為兩種：一是帶病苗木或帶病接穗。二是蚜蟲與亞洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)，果實患病后嚴重影響產量和品質，果實難以從綠轉黃，糖酸比、外形、風味口感都無法達到商業售賣需求[3,4]，甚至造成柑橘樹枯死，果樹感染之后一般采用焚燒處理。

黃龍病由于其毀滅性的危害而被比作為柑橘產業的“癌癥”[5]，在世界的五大洲約50個國家和地區均有發生[6-8]。黃龍病研究時間已經超過半個世紀，但是對患黃龍病的臍橙一般也只做廢棄處理，為了挽回果農的損失，探尋黃龍病果皮果肉的加工再利用價值，可以提取黃龍病果皮中精油，提取黃龍病果肉中膳食纖維進行改性[9]，從而節約資源、創造經濟價值。

代謝組學是一個新興的分析化學領域，專注于小型代謝物的鑒定[10]。代謝組學最初主要應用于藥物應用，現已成為農業和食品科學中的不可或缺的工具，常常被用于表征植物受外界影響后的代謝動態變化。代謝組學技術已經能夠識別不同地區的同一植物品種代謝成分的差異，例如本課題組采用UPLC-QTOF-MS結合非靶向代謝組學對中國6個贛南地區臍橙和7個非贛南地區臍橙進行地理來源的鑒別，并鑒定出了42個潛在差異代謝物[11]。Parastar H[12]等采集了4種柑橘屬植物(檸檬、橙、柑橘、葡萄柚)的18個批次樣本，并采用多種化學計量學方法對其果實皮的次級代謝產物進行GC-MS指紋性分析，結果表明代謝組學方法可以用于對柑橘類植物的辨別。

本實驗將基于代謝組學技術，利用UPLC-QTOF-MS分析正常臍橙與患黃龍病臍橙化學成分差異，結合化學計量軟件進行差異分析，找出標志性成分，并分析其變化原因，對患病臍橙的成分性質、含量變化，以分布規律進行研究[13]，探究患病臍橙在加工、營養和保健上的剩余價值，充分利用資源，為受災農戶挽回一定的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用贛南臍橙采于尋烏縣源興果業有限公司臍橙基地(N24.96°/E115.65°)。從結果期開始，每半個月進行一次田間診斷，發現有明顯感染黃龍病癥狀的臍橙果樹(樹梢黃化，果實畸形或出現紅鼻子果)，做好標記和隔離措施。到臍橙的成熟期(每年10至11月)，從做好標記的患病果樹樹冠中央到外圍隨機采摘12個樣品，同時在最近正常臍橙果樹上隨機摘取達到正常售賣標準的12個正常臍橙樣品。果實樣品采收后立即用蒸餾水洗凈，并用攪拌機榨取果肉，放于4 ℃冰箱保存備用。

甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，美國ROE公司；屈臣氏蒸餾水，屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設備

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200E型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠；料理機，浙江蘇泊爾股份有限公司；Agilent6538四級桿-飛行時間質譜聯用儀(配有Agilent1290高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器)、Agilent MassHunter數據處理軟件與電噴霧離子源，美國Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

精確稱取2.00 g贛南臍橙果肉勻漿或果皮碎塊，加入4 mL 80%甲醇溶液超聲提取10 min，置于離心機中4800 r/min離心20 min，將收集的上清液用0.22 μm PTFE濾膜過濾于2.5 mL棕色螺旋進樣瓶中，用于UPLC-Q-TOF/MS的非靶向代謝組學檢測[14]。

從每個樣品的上清液中各吸取50 μL上清液混合在一起，制成質量控制樣本QC(quality control)。在開始進行樣品的序列分析之前，將QC樣品連續注入10 次以平衡系統，確保所收集數據的可重復性，然后，在整個分析過程中定期分析QC樣品(每隔5個樣本)，以監測儀器的穩定性[15]。同時，在QC樣本分析后，注入空白樣品(MeOH / H2O，80:20,v / v)，以減少序列分析過程中的殘留效應。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：色譜柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL；梯度洗脫：0～12 min，5%～30% B；12～27 min，30%～75%B；27～32 min，78%～95%；32～35 min，95%～5%；35～37 min，5%；后運行時間：2 min。

1.3.3 質譜條件

電子模式：電噴霧電離；干燥氣(N2)溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 L·min-1；霧化器壓力，40 psig；毛細管電壓(VCap)：3500 V；碰撞電壓：120 V；質量掃描范圍：50～1700 m/z；二級碰撞能：10～50 V。在運行過程中，連續注入含有質量標準112.985 6(TFANH4)和1033.9881(HP-0921)的溶液作為質量校準的校準液，以保證離子理想的質量精度。

1.4 數據處理與分析

原始數據通過Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00(Agilent,USA)采集，并使用Agilent Masshunter Profinder B.06.00(Agilent,USA)軟件將UPLC-QTOF-MS采集的原始數據文件(.d)進行預處理，包括數據挖掘對齊，參數如下：使用批量遞歸特征提取；峰過濾器-峰高(輪廓和質心質譜圖)：≥300 counts；離子種類-正離子：+H，+Na，+K；負離子：-H，+Cl，+CH3COO；峰高-絕對峰高：≥5000；對齊誤差：保留時間誤差：2%±0.20 min；質量窗口：7×10-6±2.00 mDa。處理完畢后把文件導出為.csv文件，導入到Metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca)進行后續處理[16,17]：舍棄空值大于50%的化合物數據，其余用該化合物峰面積平均數填補；剔除質控樣品中相對標準偏差(RSD)大于25%的離子數據；用總數歸一化、對數轉換和柏拉圖標準化對數據進行歸一化處理。保存處理后的數據為.csv格式。然后將特征化合物進行多元統計學分析，包括主成分分析(principal component analysis,PCA)，正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)，聚類分析(cluster analysis，CA)以及熱圖分析，這種方法在之前研究證明是可行的[18]。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

為了獲得高質量、可靠性強和高質量的非靶向代謝組學研究數據。本文對樣品分析方法的穩定性和數據的可靠性進行了監測：分別從正負離子模式的QC 樣本中隨機挑選6個特征離子，正離子模式：0.86(RT)-120.042(m/z)，8.84(RT)-386.092(m/z)，13.85(RT)-432.208(m/z)，15.99(RT)-648.181(m/z)，22.51(RT)-740.301(m/z)，32.45(RT)-368.257(m/z)；負離子模式：0.85(RT)-220.018(m/z)，7.34(RT)-264.136(m/z)，12.52(RT)-742.232(m/z)，15.96(RT)-1198.307(m/z)，21.66(RT)-727.39(m/z)，29.59(RT)-357.36(m/z)，計算離子峰面積和保留時間的相對標準偏差(relative standard deviations,RSD)來評估分析方法和儀器的重復性和穩定性。結果表示，保留時間的RSD 為0.05%～0.37%，峰面積的RSD為1.01%～6.28%。此結果表明儀器的穩定性和重復性良好，所采集的數據可用于進一步地研究與分析。此外，如圖1所示，在正負離子模式的所有QC樣本中，檢測出的化合物RSD<30%的占比分別為82.33%

RSD/%圖1 QC樣本中離子特征RSD分布圖Fig.1 RSD distribution of ions in QC samples

和79.04%。綜合以上結果，我們可以認為多元統計學分析中所存在的誤差是由樣本本身的差異造成的，而非系統或分析上存在的誤差。

2.2 主成分分析

正常、黃龍病臍橙的總離子流圖(total ion chromatogramphy,TIC)如圖2所示。

通過Agilent Masshunter Profinder B.06.00和Metaboanalyst 5.0對數據進行預處理后，數據矩陣分為正離子模式、負離子模式和果皮、果肉4種，包含了各24個樣品和515～1440個峰(RT-m/z)。在考慮所有變量的情況下，PCA是一種可以對患黃龍病和健康臍橙進行評估的一種非監督判別方法，可以對樣品進行聚類關系評估。本實驗中，PCA得分圖獲得了較好的擬合模型，其中方差R2X為0.728～0.789(表1)，均大于0.5，并高于交叉驗證預測能力Q2(0.492～0.607)。如PCA得分圖(圖3)所示，正離子模式中方差累計貢獻度前二的主成分(PCs)分別為36.9%和14.9%(果皮)和42.3%和13.7%(果肉)，負離子模式中分別為36.9%和13.5%(果皮)和42.7%和15.6%(果肉)。雖然黃龍病臍橙由于受到不同程度病害影響樣品點較分散，但是兩種臍橙樣品在圖中還是能明顯分成兩組，說明不管在正離子模式還是負離子模式中，黃龍病臍橙和正常臍橙在化學成分含量上都存在顯著差異。

2.3 OPLS-DA模型的建立和差異化合物的探尋

除了無監督模式的主成分分析以外，本實驗還使用Simca 14.0對所有樣本建立正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。每組樣品在4個OPLS-DA模型中都顯示出了明顯地分離(圖4)在OPLS-DA模型中，R2Y和Q2都大于0.5，說明建立的模型具有良好的預測能力[19]。隨后，對每個模型進行了200次的隨機置換檢驗，檢驗結果如圖5所示，檢驗后的R2和Q2在0.569～0.82之間，且P<0.001(CV-ANOVA)，表明所有的OPLS-DA模型都是穩定和可重復的。

圖5 4種OPLS-DA模型的置換檢驗Fig.5 Permutation test among four OPLS-DA models

通過統計學分析，以及各個OPLS-DA模型中的化學標記物和篩選出VIP>1.0、P<0.001(T檢驗)且Fold Change值>2或<0.5的代謝物作為差異代謝物，有助于區別黃龍病臍橙與正常臍橙。盡管有眾多化合物峰無法被鑒定，但根據準確的質荷比、保留時間和二級圖譜，對比metlin數據庫、Ms-dial軟件和文獻，在正負離子模式的果皮和果肉中鑒定出了28種(果皮21種、果肉11種)潛在的差異化合物(表2)，包括氨基酸、有機酸、糖苷、酯類等。

表1 不同模型下的PCA和OPLS-DA的參數Table.1 The parameters of different PCA and OPLS-DA models

表2 基于UPLC-QTOF-MS的患黃龍病臍橙與正常臍橙的差異化合物Tab.2 Differential compounds of Huanglongbing and normal navel orange based on UPLC-QTOF-MS

續表2 基于UPLC-QTOF-MS的患黃龍病臍橙與正常臍橙的差異化合物Tab.2 Differential compounds of Huanglongbing and normal navel orange based on UPLC-QTOF-MS

在鑒定差異化合物后，差異化合物在兩種臍橙中的相對含量如圖6，圖7所示。從圖中可以看到，贛南臍橙在患黃龍病后，果皮中的氨基酸和包括柚皮苷在內的糖苷類含量明顯增高，這與王強[9]等的研究結果一致，其中苯丙氨酸含量在患病臍橙果皮中偏高可能是因為苯丙素類的代謝在植物抵御外界威脅中起到重要的作用[20]。Kiefl.J[21]等對患黃龍病臍橙的研究發現，被感染的果實有刺激性苦澀味和金屬味，果汁味淡，這與本研究中發現的果皮中葡萄糖含量降低，果肉中檸檬苦素含量升高也能相互對應。康聰[22]等研究發現黃龍病菌會影響砂糖橘的氨基酸的代謝，這與我們發現患病果肉中的氨基酸升高一致。植物中的類黃酮糖苷類主要存在的方式有以C-C鍵直接連接于類黃酮糖苷配基上或者以O-linked的方式連接于類黃酮糖苷配基的羥基上[23]，柑橘中以黃烷酮-O-糖苷類、黃酮-O-糖苷類和黃酮-C-糖苷類含量最為豐富[24]，而通過本實驗可以得到的剃刀草素-3-O-蕓香苷、蘆丁、木犀草素-7-蕓香苷、香葉木素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷和柚皮苷在患病后含量增加。其余的差異化合物比如異黃連素、脫落酸、米托里定等在患病臍橙中含量偏少，而蘆丁、8-羥基芥子酸、4-羥基睪酮、對羥基苯丙胺、苯丙氨酸、6''-O-L-Arabinopyranosylastragalin等則是在患病臍橙中含量更多。

圖6 2種臍橙果肉中差異化合物的含量Fig.6 Contents of differential compounds in pulp of two kinds of navel oranges

圖7 兩種臍橙果皮中差異化合物的含量Fig.7 Contents of differential compounds in peels of two kinds of navel oranges

2.4 差異成分的聚類分析

通過MetaboAnalyst 5.0對黃龍病臍橙差異成分做聚類分析，計算差異成分皮爾遜系數可以繪制出如下熱圖(Heatmap)(圖8，圖9)，熱圖可以有效地對數據質量進行控制并展示研究對象的差異變化情況。從熱圖可以看出，兩種組分的臍橙可以被明顯分開，這與PCA和OPLS-DA的結果一致。聚類分析顯示，糖苷類化合物比如剃刀草素-3-O-蕓香苷、木犀草素-7-蕓香苷、蘆丁、香葉木素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-蕓香糖苷和柚皮苷聚為一類，說明他們在柑橘體內可能具有相關性，含量變化趨勢相近。此外。脫落酸、異黃連素、葡萄糖和氨基酸聚為一類，同樣說明它們的含量變化趨勢接近，具有相近的生物合成途徑。

圖8 患黃龍病與正常臍橙果皮的差異化合物的熱圖分析Fig.8 Heatmap analysis of differential compounds among peers of huanglongbing and normal navel oranges

圖9 患黃龍病與正常臍橙果肉的差異化合物的熱圖分析Fig.9 Heatmap analysis of differential compounds among pulp of huanglongbing and normal navel oranges

3 總結

本實驗采用了UPLC-QTOF-MS對患黃龍病的臍橙與正常臍橙的非揮發性成分進行了測定。結合化學計量學軟件，利用主成分分析結果和正交偏最小二乘判別分析，篩選出28種差異化合物。其中黃酮糖苷類化合物是區分兩種臍橙的主要差異代謝物，在植物感染黃龍病后，果實中的黃酮糖苷類物質有富集的效果。聚類熱圖分析與主成分分析一致，將正常臍橙樣品和黃龍病臍橙分開。同時相關性分析發現糖苷類化合物和柚皮苷動態變化趨勢一致，脫落酸、異黃連素、葡萄糖和氨基酸動態變化趨勢一致。這些結果有助于我們了解臍橙患黃龍病后的成分變化，給我們在防治或者鑒別患病果樹提供了一個新的思路，同時也對患病臍橙果實的加工處理提供了新的方向。