清腦益智方對血管性癡呆大鼠腦血流量及血脂水平的影響*

石秀菊 ，王昭琦 ，魏寶鈺 ，朱金墻

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.吉林濟康堂醫藥有限公司，通化 134001）

血管性癡呆（VaD）是指由各種腦血管疾病導致腦低灌注損傷而引起的進行性智能障礙綜合征。臨床流行病學調查表明，在歐美國家，VaD占總癡呆的15%～20%，僅次于阿爾茨海默病（AD），但在亞洲（包括中國）及許多發展中國家，其發病率高于AD[1]。隨著全球人口老齡化的迅速發展，VaD患者數量日益增長，給人類健康帶來巨大挑戰。研究表明，腦血流量（CBF）降低可引起神經元損傷，導致學習與記憶障礙、認知功能減退，最終造成癡呆的發生與發展[2]。動脈粥樣硬化（AS）可使動脈血管喪失彈性，最終導致管腔斑塊破裂形成血栓，或造成血管腔變窄，危及頸動脈和主動脈等大中型動脈。而頸動脈是向腦供血的重要動脈，一旦發生AS可導致CBF減少，是VaD的重要病因之一，而血脂異常是AS發生的始動因素[3]。國內外諸多研究發現，VaD患者頸總動脈粥樣硬化病變明顯，血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量明顯增高，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量明顯降低，表明VaD患者的血脂水平與其疾病進展密切相關，血脂升高可加重頸動脈粥樣硬化程度，進而降低CBF，加重VaD病情[4-5]。因此，采取積極措施降低血脂水平，可預防和抗AS，從而有效防治VaD。

本課題組臨床研究發現，清腦益智方（QNYZF）可有效改善VaD患者的認知功能和日常生活社交能力，并可調節腦血流狀態和血液流變性等[6]。實驗研究表明，QNYZF能有效改善VaD大鼠的認知功能，其作用機制包括抗神經元凋亡、促進神經元突觸重塑以及促進神經干細胞向神經元分化等[7-11]。基于CBF、血脂異常與VaD的密切關系，本研究在前期研究的基礎上，考察QNYZF對VaD大鼠CBF和血脂水平的影響，初步探討其作用機制，為其臨床治療VaD提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，清潔級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.1.2 主要試劑 異氟烷（河北一品制藥有限公司，批號：C002151102）、硫酸慶大霉素注射液（天津金耀藥業有限公司，批號：1405081）、水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20151010），TC測定試劑盒（批號：161481）、TG測定試劑盒（批號：160871）、LDL-C 測定試劑盒（批號：160582）、HDL-C測定試劑盒（批號：160581）為中生北控生物科技股份有限公司產品。

1.1.3 實驗藥物 QNYZF（主要組成為人參、丹參、麥冬、黃連等）濃縮液由天津中醫藥大學中醫藥研究院藥學部制備。采用水煎醇沉法提取，制備成200%的濃縮液（含生藥濃度2 g/mL），4℃保存，備用。

1.1.4 主要儀器 江灣Ⅰ型C立體定位儀與激光多普勒血流監測儀（英國MOOR公司）、低速自動平衡離心機（上海利鑫堅高速離心機有限公司）、全自動生化分析儀（日本日立公司，型號：日立7020型ZSE）。

1.2 分組與給藥 將大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組、模型組、QNYZF低、中、高劑量組，共5組，每組11只。QNYZF中劑量組的給藥劑量根據體表面積法[12]由人的臨床劑量換算，QNYZF低、中、高劑量組分別灌胃給予QNYZF濃縮液3.5、7、14g/（kg·d），假手術組與模型組灌服等體積生理鹽水。手術結束1周后開始灌胃給藥，連續給藥4周。

1.3 模型制備 各組大鼠術前禁食不禁水12 h。將大鼠放入密閉的玻璃容器中，通入3.5%異氟烷，密切觀察大鼠的自主呼吸。待大鼠翻正反射消失后，移至手術臺，仰臥固定，并持續吸入1.5%異氟烷，維持其麻醉狀態。剃除頸部毛發，用碘伏消毒皮膚，沿頸正中縱向剪開皮膚和皮下組織，逐層鈍性分離皮下肌肉及結締組織，使雙側頸總動脈暴露。小心分離迷走神經，用3-0號手術線分別結扎頸總動脈近心端和遠心端，并從中間剪斷。向傷口滴加適量慶大霉素預防感染，后用4-0號手術線逐層縫合。保持37℃體溫，待動物蘇醒后放回籠中。假手術組大鼠雙側頸總動脈只埋線不結扎，其他處理同模型組。

1.4 CBF檢測 給藥4周后，采用小動物麻醉機給大鼠吸入異氟烷使其麻醉，俯臥位固定于37℃恒溫加熱器，頭頂部去毛備皮，碘酒常規消毒，行縱向正中切口，鈍性分離皮下組織，撕開骨膜，暴露顱骨，用棉簽蘸取適量稀釋的雙氧水（H2O2）擦拭進行消毒并止血。用腦立體定位儀按《大鼠腦立體定位圖譜》，前囟后4 mm、中線旁2 mm、深3.5 mm定位海馬，用速干膠將探頭固定，涂抹適量促凝劑加速凝固。待探頭固定后打開AMY軟件檢測CBF記錄結果，以血流量/時間曲線顯示并以單位時間內的血流量平均值[以相對電壓值表示（單位是PU），表示組織血流量的相對單位，它的變化值直接反映血流量的改變，1 PU=10 mV電壓]進行統計。穩定5～8 min后記錄CBF并保存數據。向傷口滴加適量慶大霉素防止感染，用3-0號手術線縫合，將大鼠置于恒溫加熱毯，待其蘇醒后放回鼠籠。

1.5 血清 TC、TG、LDL-C和 HDL-C含量檢測CBF檢測結束后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）使大鼠麻醉，迅速從腹主動脈取血，3 500 r/min離心15 min（離心半徑11.5 cm），收集血清，分裝于1.5 mL的EP離心管內，-80℃凍存，備用。按試劑盒說明書進行操作，采用全自動生化檢測儀檢測大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量。

1.6 統計學分析 應用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析，所有實驗數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QNYZF對VaD大鼠CBF的影響 與假手術組比較，模型組大鼠CBF降低（P<0.05）；與模型組比較，QNYZF中、高劑量組大鼠CBF升高（P<0.05或P<0.01），低劑量組呈升高趨勢但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。

圖1 QNYZF對VaD大鼠CBF的影響（±s）

2.2 QNYZF對VaD大鼠血清中TC含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清中TC含量增加（P<0.05）；與模型組比較，QNYZF低、中、高劑量組大鼠血清中TC含量降低（P<0.05或P<0.01）。見圖2。

圖2 QNYZF對VaD大鼠血清中TC含量的影響（±s）

2.3 QNYZF對VaD大鼠血清中TG含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清中TG含量增加（P<0.05）；與模型組比較，QNYZF低、中、高劑量組大鼠血清中TG含量降低（P<0.01）。見圖3。

圖3 QNYZF對VaD大鼠血清中TG含量的影響（±s）

2.4 QNYZF對VaD大鼠血清中LDL-C含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清中LDL-C含量增加（P<0.05）；與模型組比較，QNYZF低、中、高劑量組大鼠血清中LDL-C含量降低（P<0.01）。見圖4。

圖4 QNYZF對VaD大鼠血清中LDL-C含量的影響（±s）

2.5 QNYZF對VaD大鼠血清中HDL-C含量的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清中HDL-C含量無顯著變化（P>0.05）；與模型組比較，QNYZF低、中、高劑量組大鼠血清中HDL-C含量亦無明顯變化（P>0.05）。見圖 5。

圖5 QNYZF對VaD大鼠血清中HDL-C含量的影響（±s）

3 討論

中醫將VaD歸為“善忘”“愚癡”“癡證”“神呆”“不慧”等范疇，認為VaD是一種“虛、痰、瘀”合致為患的本虛標實、虛實間雜的疾病[13]。西醫研究表明，VaD的致病因素極其復雜，其中血脂異常是其重要的致病因素之一[14]。血脂異常誘發的頸總動脈粥樣硬化可導致CBF減少，腦組織灌注不足，造成腦組織缺血、缺氧，代謝異常與神經元損傷，造成大腦認知功能減退，促進VaD發生[4]。臨床研究表明，VaD患者也常伴有脂質代謝紊亂以及血流動力學異常等[15]，且有研究認為血管性認知功能障礙與血脂水平有關[16]。由此可知，血脂代謝紊亂與VaD關系密切，在一定程度上相互促進、互為因果。

水液代謝異常可形成痰濕瘀滯血脈；血瘀不行，影響膏脂和津液的轉化、輸布而成痰，進一步加劇痰濁阻滯氣血運行[17]。可見痰與瘀能夠相互轉化，其中瘀證常繼發于痰證，在病理變化過程中互為因果，痰瘀既是血脂異常的病理產物又是其致病因素，兩者既可以相互轉化又可以相互為病，并且貫穿于血脂異常的始終，終至痰瘀互結難解，形成VaD等一系列相關疾病。血脂中HDL-C是將體內膽固醇轉移至肝臟進行代謝活動的重要媒介，具有抗AS作用；LDL-C是人體內最多的脂蛋白，富含脂質，其中膽固醇約占50%，可與動脈壁上的蛋白多糖結合，產生不溶性沉淀，刺激纖維組織增生，還可與動脈內皮上的LDL-C受體結合，沉積在動脈內膜上，導致動脈內膜增厚并形成斑塊，發生AS。當脂質代謝發生異常時，TG、TC和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，可導致頸動脈不穩定斑塊的形成，誘發AS。臨床發現，VaD患者的TG、TC和LDL-C明顯高于對照組，而HDL-C水平則明顯低于對照組，提示血脂異常與VaD有關[5]。因此，盡早干預血脂代謝是早期預防和治療VaD的重要措施。

本課題組在張伯禮院士主持的國家“九五”攻關項目“血管性癡呆的臨床和試驗研究”（96-906-09-03）資助下，分析研究了大量臨床VaD病例、古典醫籍及文獻，認為氣虛血癖，痰癖交結，釀熱生毒，損傷腦絡是本病的主要病理機制，提出了以補氣養陰、清熱解毒為主的治法，選用人參、丹參、麥冬、黃連等組成QNYZF。該方具有清腦解毒、祛痰通絡、開竅益智的功效，可有效改善VaD患者的認知功能和日常生活社交能力，并能調節其腦血流狀態和血液流變性[6]。前期研究表明，QNYZF可有效改善VaD大鼠認知功能，降低細胞內脂質過氧化物含量，改善腦代謝，保護神經元的超微結構，抑制神經元凋亡，促進神經元突觸重塑，促進神經干細胞向神經元分化等[7-11]。本研究在此基礎上，采用雙側結扎頸總動脈（2-VO）法復制大鼠VaD模型，考察QNYZF對VaD大鼠CBF及血脂水平的影響。結果顯示，VaD大鼠的血脂水平出現顯著提高，與臨床研究報道一致[18]。QNYZF可有效增加VaD大鼠CBF，并降低TC、TG和LDL-C含量，而對HDL-C含量無明顯影響，表明QNYZF可通過降低VaD大鼠血脂水平以增加CBF，進而延緩疾病進展，改善認知功能，這可能是QNYZF治療VaD的作用機制之一，但其作用機制還有待進一步深入探討。