基于環介導等溫擴增技術快速鑒定寬體金線蛭

張環宇 ，王文秀 ，高晗 ，譚偉 ，余小磊 ，李振國 ，田曉軒

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；3.牡丹江友搏藥業有限責任公司，牡丹江 157000）

水蛭為螞蟥（Whitmania Pigra Whitman）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman）或柳葉螞蟥（Whitmania acranutata Whitman）的干燥全體[1]。目前中藥材市場中主要流通品種為螞蝗，又名寬體金線蛭，為藥用優良品種[2-3]。近年來，水蛭作為原料藥被大量用于中藥制劑的開發，導致水蛭中藥材價格上漲，常有不法藥材銷售商對水蛭中藥材摻假出售[3]。因此，對水蛭的質量鑒別尤為重要。

傳統水蛭鑒定方法主要包括性狀鑒別及理化鑒別[4-5]，這些技術在水蛭鑒定和質量控制中發揮了關鍵作用。隨著分子生物學的發展，分子鑒別技術在中藥材鑒定中得到了廣泛的應用，與傳統的形態和化學檢測方法相比，分子技術具有更高的準確度。環介導等溫擴增技術（LAMP）是一種新型的等溫核酸擴增技術，因其操作簡便、儀器費用低廉、結果分析簡單、快速等優點成為目前常用的核酸檢測技術之一[6-7]。因此，本研究針對水蛭線粒體細胞色素氧化酶I（COI）基因序列設計LAMP引物，結合熒光染料法對寬體金線蛭及其常見混偽品進行快速鑒別。

1 材料與儀器

1.1 藥品 取采自中藥材市場的4份水蛭樣品進行特異性實驗，見表1。實際樣品檢測材料共9份水蛭樣品，見表2。樣品經牡丹江友搏藥業有限責任公司張孝晨根據樣品形態等特征進行性狀鑒定。

表1 實驗材料

表2 實際樣品檢測材料

1.2 儀器 凝膠成像分析儀（Cuene Genins）；DYY-8C型核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ZHJH-C1112B型超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Eppendorf）；ZF-6型紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；JA3003型電子精密天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.3 試劑 Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶（紐英倫生物技術有限公司）；Tks Gflex DNA聚合酶（寶日醫生物技術有限公司）；瓊脂糖（Lonza）；無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠）；6×上樣緩沖液（Loading buffer，寶日醫生物技術有限公司）；10 000×SYBR Green I核酸染料（北京索萊寶科技有限公司）；DuRed核酸染料（北京泛博生物化學有限公司）；D2000 DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；50×TAE（合肥志宏生物技術有限公司）；無酶水（Biosharp）；DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Tks Gflex DNA聚合酶（寶日醫生物技術有限公司）；等溫擴增反應緩沖液（紐英倫生物技術有限公司）；MgSO4（100 mmol/L，紐英倫生物技術有限公司）。

2 實驗方法及結果

2.1 引物特異性檢測實驗 剪取4份特異性實驗樣品（2條寬體金線蛭、1條光潤金線蛭、1條日本醫蛭）肌肉組織約30 mg，將其放入潔凈的1.5 mL離心管中，另取一離心管以無酶水代替DNA模板作為陰性對照。按照動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，取5 μL提取產物，加入1 μL的6×Loading buffer混勻后于DuRed染色的1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA提取質量及長度。使用紫外分光光度計測量所提取的DNA濃度及A260/A280，儲存于-20°C。選擇通用引物COI（見表3）對提取的DNA 進行擴增，25 μL 反應體系包括 12.5 μL 2×反應緩沖液、0.5 μL 10 μmol/L LCO1490（10 μmol/L）、0.5 μL 10 μmol/L HCO2198（10 μmol/L）、0.5 μL DNA模板、1.25 U Tks Gflex DNA 聚合酶、10.5 μL 無酶水。引物序列見表3。PCR檢測在PCR儀上進行，擴增程序為：98℃預變性1 min，98℃變性10 s，52℃退火15 s，68℃延伸30 s，40個循環，68℃再延伸5 min。擴增結束后取5 μL擴增產物，加入1 μL 6×Loading buffer混勻后于DuRed染色的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，選擇陽性PCR產物樣品進行一代雙端測序。一代測序結果見表1。

2.2 LAMP引物設計與合成 將上述一代測序所得4條水蛭序列進行LAMP引物設計，使用Geneious 8.0.4去除引物區，利用MAFFT v7.271進行對齊，篩選寬體金線蛭特有的變異位點，針對其變異位點在網站（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）設計LAMP引物組，挑選3組引物組于Oligo 7進行引物評價，篩選引物質量最佳的1組引物作為本次實驗所用引物組。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，LAMP引物序列見表3。

表3 引物及反應條件

2.3 LAMP法檢測中藥材寬體金線蛭方法的建立 配置反應體系為25 μL，包括0.2 μmol/L sz-F3（10 μmol/L）、0.2 μmol/L sz-B3（10 μmol/L）、1.6 μmol/L sz-FIP（10 μmol/L）、1.6 μmol/L sz-BIP（10 μmol/L）、1×等溫擴增反應緩沖液、8 U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、6 mmol/L MgSO4（100 mmol/L）、1.4 mmol/L三磷酸脫氧核苷酸（dNTPs）（10 mmol/L）、1 μL DNA模板，加無酶水補充總體積至25 μL。將反應液于64℃恒溫反應60 min，80℃下孵育10 min結束反應。反應結束后取5 μL擴增產物于含DuRed核酸染料的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳（觀察有無梯狀條帶及條帶的明亮程度），電壓110 V，電泳30 min。在余下20 μL擴增產物中加入0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料，在自然燈下及254 nm紫外光下觀察顏色變化。

2.4 LAMP特異性檢測結果 擴增產物于含DuRed核酸染料的1%瓊脂糖凝膠上電泳，結果見圖1A，寬體金線蛭呈梯狀條帶（陽性），對照組無條帶產生（陰性）。在余下20 μL擴增產物中加入0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料，于自然燈下觀察結果見圖1B，寬體金線蛭在自然光下變為綠色（陽性），光潤金線蛭、日本醫蛭、陰性對照均呈橙黃色（陰性）。將加入了0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料的擴增產物置于254 nm紫外燈下觀察顏色變化，結果見圖1C，寬體金線蛭在254 nm紫外光下呈綠色熒光（陽性），對照組無熒光產生（陰性）。以上結果表明，所設計的LAMP引物能對寬體金線蛭進行特異性擴增。

圖1 LAMP反應特異性檢測結果

3 水蛭實際樣品檢測

收集市售9份水蛭樣品，按照“2.1”項所述方法進行DNA提取、PCR擴增及一代測序，對所收集樣品進行分子鑒定，一代測序結果見表2。運用所設計的LAMP引物按上述步驟進行LAMP擴增，反應時間為60 min，對水蛭實際樣品進行檢測。檢測結果見圖2。擴增產物于含DuRed核酸染料的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，結果見圖2A，編號K1、K2、K3樣品均呈梯狀條帶（陽性），對照組無條帶產生（陰性）。在余下20 μL擴增產物中加入0.2 μL 10 000×SYBRGreenⅠ核酸染料，自然燈下觀察結果見圖2B，編號K1、K2、K3樣品在自然光下變為綠色（陽性），對照組呈橙黃色（陰性）。將加入了0.2 μL 10 000×SYBR GreenⅠ核酸染料的擴增產物置于254 nm紫外燈下觀察，結果見圖2C，編號K1、K2、K3樣品在254 nm紫外光下呈綠色熒光（陽性），對照組無熒光產生（陰性）。3種檢測方式中的陽性結果樣品與表2中分子鑒定結果為寬體金線蛭的樣品一致。以上結果表明，本研究所建立的寬體金線蛭LAMP檢測技術可實現對市售寬體金線蛭及其常見混偽品的快速鑒別。

圖2 LAMP實際樣品檢測結果

4 討論

準確檢測寬體金線蛭對水蛭的臨床用藥安全具有重要意義。目前水蛭的鑒別方法，如高效液相色譜法、高效毛細管電泳法等通常需要大型儀器設備，不利于寬體金線蛭的現場快速鑒別。因此，本研究通過設計4條LAMP特異性引物，利用具有鏈置換活性的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，在64°C恒溫下保溫60 min即可結束反應，無需熱循環儀。且本研究建立了3種LAMP檢測方法，分別為瓊脂糖凝膠電泳法及在自然光、254 nm紫外光下肉眼觀察核酸染料SYBR GreenⅠ的顏色變化，以對寬體金線蛭進行準確識別。該檢測體系的結果判定只需加入核酸染料，肉眼即可觀察到顏色變化，操作簡便。因此本研究提供了寬體金線蛭的基源快速鑒定方法，具有操作簡便、儀器費用低廉、特異性良好、檢測快速等優點。

適宜的靶標序列是DNA分子鑒定準確性的基礎保障。研究表明，以COI為靶標序列可將正品水蛭與其他混偽品明顯區分[3]。因此，本研究基于線粒體COI基因序列建立了中藥材寬體金線蛭的LAMP檢測體系。本研究的結果表明，利用LAMP技術可成功將寬體金線蛭與光潤金線蛭、日本醫蛭、歐洲醫蛭及牛蛭屬物種區分開來，且特異性良好。