基于TWEAK/Fn14信號(hào)通路探討大黃酚對(duì)OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠的保護(hù)作用

王婷 ，李海艦 ，廖明 ，曾伍姣

（1.廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510317；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510095）

哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，其主要特征有可逆性氣流受限、一系列氣道結(jié)構(gòu)改變和對(duì)多種刺激因素呈現(xiàn)高反應(yīng)性[1]。而臨床癥狀表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的氣急、咳嗽、喘息、胸悶等。據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示全球目前大約有3.3億的哮喘患者[2]，中國(guó)的哮喘患者約有3 000萬(wàn)。值得注意的是隨著全球環(huán)境污染逐漸加重，全球哮喘患病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們的身體健康。目前尚未完全闡明其發(fā)病機(jī)制，可能與炎癥、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[3]。而臨床上常常使用糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑等藥物進(jìn)行對(duì)癥治療[4]。但長(zhǎng)期大劑量給藥可能引起較多的不良反應(yīng)，故尋找高效低毒的新藥是目前急需解決的問(wèn)題。

大黃酚是大黃中一種藥效明確的蒽醌類(lèi)化合物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大黃酚具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等多種藥理作用[5]，提示其可能對(duì)哮喘疾病有較好的療效。而目前暫未見(jiàn)大黃酚對(duì)哮喘的相關(guān)研究報(bào)道。此外，基于腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子（TWEAK）/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子14（Fn14）信號(hào)通路探討哮喘相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究報(bào)道也較少。本實(shí)驗(yàn)旨在闡明大黃酚是否能夠通過(guò)TWEAK/Fn14信號(hào)通路，改善卵清蛋白（OVA）致哮喘小鼠的相關(guān)癥狀，為日后的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK（粵）2017-0006]。

1.1.2 藥物與試劑 大黃酚，純度＞98%，批號(hào)：110796-20150622，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究；氫氧化鋁粉、OVA、地塞米松，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；DAB 免疫組化試劑盒、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，購(gòu)于博士德生物技術(shù)有限公司；β-actin、TWEAK和Fn14抗體，購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.1.3 儀器 403型超聲霧化器：江蘇魚(yú)躍科技發(fā)展有限公司；JK-RM-60型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；CX23CX33型Olympus顯微鏡：日本Olympus公司；SAF-680型酶標(biāo)儀：上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；H1650R型高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀有限公司；KEEBIO-VE186型電泳儀：上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組（CON組）、模型組（OVA組）、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組（DEX組）、大黃酚低劑量組（RHU-L組）、大黃酚中劑量組（RHU-M組）和大黃酚高劑量組（RHU-H組）。

1.2.2 哮喘小鼠模型的建立 除CON組外，其余各組分3次（第1、7、14天）對(duì)各組小鼠進(jìn)行OVA致敏，參考文獻(xiàn)[6]的建模方法，具體方法如下：小鼠每次腹腔注射200 μL OVA溶液（含4 mg氫氧化鋁和100 μg OVA），CON組腹腔注射等量的生理鹽水。第21天后對(duì)各組小鼠進(jìn)行霧化激發(fā)（連續(xù)4d），CON組以等量生理鹽水霧化吸入。RHU-L組、RHU-M組和RHU-H組小鼠在第15天時(shí)分別用濃度為50、100、200 mg/kg的大黃酚灌胃給藥，DEX組小鼠使用濃度為10 mg/kg的地塞米松灌胃給藥，CON組和OVA組灌胃等量生理鹽水，每日給藥1次。

1.2.3 標(biāo)本采集及處理 各組末次激發(fā)24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。小鼠固定于手術(shù)臺(tái)進(jìn)行氣管插管，小心暴露胸腔，血管夾夾住右主支氣管，以0.4 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重復(fù)灌洗左肺，共3次，合并灌洗液，于4℃離心機(jī)離心（700×g，10 min）。將上清液保存于-80℃冰箱，剩余的細(xì)胞沉淀用于涂片，再將小鼠右肺剝離，10%中性甲醛浸泡固定。取右肺中葉，常規(guī)石蠟包埋切片，用于蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。其余肺組織用生理鹽水沖洗后，保存于-80℃冰箱，用于蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)。

1.2.4 哮喘程度評(píng)分 根據(jù)小鼠行為學(xué)變化嚴(yán)重程度對(duì)哮喘的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)評(píng)估，具體方法如下。無(wú)異常：0分；點(diǎn)頭或震顫：1分；嗆咳：2分；腹肌痙攣：3分；跌倒：4分。

1.2.5 肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) BALF的細(xì)胞沉淀中加入500 μL生理鹽水，混勻后，取100 μL于載玻片中常規(guī)制備細(xì)胞涂片。嚴(yán)格按照Diff-Quick染色步驟進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 從10%中性甲醛中取出并選取同一部位適量大小的肺組織塊，分別經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等常規(guī)石蠟包埋切片步驟，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.7 ELISA 法測(cè)定 BALF 中 IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平 嚴(yán)格根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)，并根據(jù)樣品吸光度值確定BALF中 IL-4、IL-5、TNF-α 和 IL-1β水平。

1.2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 將各組切片分別進(jìn)行熔蠟、脫蠟、脫水處理，沸水中進(jìn)行抗原修復(fù)（30min），然后分別用TWEAK（4℃過(guò)夜孵育）一抗和二抗（常溫孵育2 h）進(jìn)行孵育。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后封片，顯微鏡下觀察。

1.2.9 Western Blot法檢測(cè) 將樣品進(jìn)行蛋白裂解后，使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒檢測(cè)各樣品蛋白濃度。每個(gè)泳道加入等量的蛋白質(zhì)樣品并分離完成后，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜中，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，并加入稀釋的一抗（TWEAK、Fn14、β-actin）4℃過(guò)夜。洗膜，并用相應(yīng)的二抗孵育3 h。使用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，Amersham Imager 600多功能成像儀采集圖像。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 19.0軟件分析各組數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊性采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)分布、方差齊性采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酚對(duì)哮喘程度評(píng)分的影響 與CON組比較，OVA組小鼠哮喘評(píng)分上升，出現(xiàn)腹肌抽搐、嗆咳及運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)等哮喘癥狀。給予大黃酚后，小鼠哮喘評(píng)分降低，哮喘癥狀減輕，呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠哮喘程度評(píng)分結(jié)果

2.2 大黃酚對(duì)BALF炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響 OVA組BALF中總細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量較CON組升高（P＜0.01）。與OVA組相比，DEX組與大黃酚各給藥組的總細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01）。與RHU-L組比較，RHU-H組和DEX組的總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 BALF炎癥細(xì)胞數(shù)量（±s）

表2 BALF炎癥細(xì)胞數(shù)量（±s）

注：與 CON 組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 OVA組比較，#P<0.05，##P<0.01；與 RHU-L 組比較，△P<0.05。

淋巴細(xì)胞（×107個(gè)/L）CON 組 10 2.53±0.11 1.22±0.06 1.35±0.65 3.37±0.36 OVA 組 10 9.67±0.72** 4.43±0.22**8.82±0.62** 18.32±1.69**DEX 組 10 4.72±0.33*##△ 2.11±0.16*##3.89±0.41*##△ 7.55±0.64**##△RHU-L 組 10 7.21±0.57**#3.36±0.37**#6.42±0.59**#13.64±0.89**##RHU-M 組 10 5.58±0.25*## 2.73±0.23*##4.85±0.32**##10.42±0.67**##RHU-H 組 10 3.83±0.26##△ 2.37±0.19## 2.88±0.17*##△ 6.67±0.53**##△組別 動(dòng)物數(shù) 總細(xì)胞（×108個(gè)/L）嗜酸性粒細(xì)胞（×108個(gè)/L）中性粒細(xì)胞（×107個(gè)/L）

2.3 大黃酚對(duì)肺組織病理學(xué)的影響 CON組小鼠氣道管壁完整，上皮細(xì)胞排列整齊，管腔無(wú)狹窄、黏液，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。OVA組小鼠氣道管壁完整性明顯受損，上皮細(xì)胞排列紊亂，管腔明顯縮窄，可見(jiàn)較多黏液及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與OVA組比較，DEX組及大黃酚各給藥組氣道管壁較OVA組相對(duì)完整，上皮細(xì)胞脫落數(shù)量、管腔黏液、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，×10）

2.4 大黃酚對(duì)BALF中IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平的影響 OVA組 BALF中 IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平較CON組升高（P＜0.01）。與OVA組相比，DEX組與大黃酚各給藥組的IL-4、IL-5、TNF-α 和IL-1β水平降低（P＜0.05或 P＜0.01）。與RHU-L組比較，RHU-H組的IL-5、TNF-α和IL-1β水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖 2。

圖2 各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、TNF-α和IL-1β水平（±s，n=10）

2.5 大黃酚對(duì)各組小鼠肺組織中TWEAK表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見(jiàn)，與CON組比較，OVA組氣道周?chē)鶷WEAK蛋白表達(dá)升高。與OVA組比較，DEX組與大黃酚各給藥組的TWEAK蛋白表達(dá)降低。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中TWEAK表達(dá)情況（HE 染色，×40）

2.6 大黃酚對(duì)肺組織中TWEAK和Fn14蛋白表達(dá)的影響 與CON組比較，各組小鼠肺組織中TWEAK和Fn14表達(dá)量升高（P<0.05或P<0.01）。與OVA組比較，DEX組與大黃酚各給藥組小鼠肺組織中TWEAK和Fn14表達(dá)量降低（P<0.05或P<0.01）。與RHU-L組比較，RHU-H組小鼠TWEAK和Fn14表達(dá)量降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠肺組織中TWEAK和Fn14表達(dá)情況（±s，n=10）

3 討論

哮喘屬于慢性炎癥性疾病范疇，主要特征有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）、氣道高反應(yīng)性及黏液分泌過(guò)多等，引起一系列的氣道炎癥性反應(yīng)。哮喘的發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，涉及多種炎性細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子。有研究報(bào)道TWEAK/Fn14通路在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[7]。然而，基于長(zhǎng)期大劑量使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致較多的不良反應(yīng)發(fā)生，故目前仍需迫切尋求具有高效低毒的治療藥物來(lái)提高哮喘患者的生存質(zhì)量。大黃酚是一種從中藥大黃中純化的單體化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大黃酚具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等多種藥理作用，提示其可能對(duì)哮喘有著較好的保護(hù)作用。而本研究也證實(shí)大黃酚能夠通過(guò)TWEAK/Fn14信號(hào)通路明顯減輕OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠的炎癥性癥狀，表明大黃酚可能是防治支氣管哮喘疾病潛在的有效藥物。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)使用大黃酚的最高給藥劑量（小鼠給藥劑量200mg/kg，折算成人給藥劑量為22.17 mg/kg）相當(dāng)于臨床大承氣湯中大黃酚的人每日劑量（0.55 mg/kg）的40倍[8]，有研究表明大黃蒽醌類(lèi)成分人的毒性劑量可高達(dá)4 500 mg/kg[9]。而本實(shí)驗(yàn)分別以50、100、200 mg/kg的大黃酚灌胃給藥后，均未發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉情況，但大黃酚各給藥組小鼠的糞便排泄量比CON組多。此外，該劑量范圍內(nèi)給藥尚未發(fā)現(xiàn)其他不良反應(yīng)。

炎性細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等，遷移至肺組織是形成哮喘氣道炎癥的重要致病因素，其中炎性細(xì)胞的定向遷移受到多種趨化細(xì)胞因子的復(fù)雜調(diào)控，輔助T細(xì)胞（Th）1/Th2失衡是目前被廣泛接受的哮喘重要發(fā)病機(jī)制之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)OVA誘導(dǎo)的小鼠BALF中增加了大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，包括淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。同時(shí)，OVA誘導(dǎo)的OVA組小鼠BALF中促炎細(xì)胞因子輔助 T 細(xì)胞（Th）1（TNF-α、IL-1β）、Th2（IL-4、IL-5、IL-13）的水平明顯升高，表明 OVA 誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型破壞了Th1與Th2的平衡。HE染色結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)的OVA組小鼠氣管內(nèi)有大量黏液和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。綜上所述，提示了小鼠過(guò)敏性哮喘模型建立成功。而給予不同劑量的大黃酚后，可明顯降低BALF中淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)，HE染色結(jié)果顯示不同劑量大黃酚可減少氣管內(nèi)的黏液分泌和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯改善小鼠哮喘癥狀。TWEAK是一種可以表達(dá)于多種細(xì)胞的Ⅱ型跨膜蛋白，TWEAK通過(guò)Fn14發(fā)揮對(duì)其他細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，包括促進(jìn)炎癥細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成等[11]。有研究發(fā)現(xiàn)TWEAK/Fn14通路在哮喘氣道炎癥發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。本研究免疫組織化學(xué)染色和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明大黃酚可以降低肺組織中TWEAK和Fn14的表達(dá)水平，提示大黃酚可能通過(guò)作用于TWEAK/Fn14信號(hào)通路，從而改善哮喘氣道炎癥癥狀。

綜上所述，大黃酚通過(guò)減少哮喘程度評(píng)分、減少肺組織中黏液量、減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制炎癥細(xì)胞因子，并降低TWEAK和Fn14蛋白生成，從而改善哮喘氣道炎癥，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TWEAK/Fn14信號(hào)通路密切相關(guān)。