復發性流產患者T淋巴細胞及其亞群變化研究進展*

余甜，舒紅英，楊小頎

（1.陜西中醫藥大學第二臨床醫學院，咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學第二附屬醫院，咸陽 712000）

從免疫學角度來講，胎兒被認為是一類特殊的同種半異基因移植物。成功種植意味著胚胎所表達的父系抗原沒有遭到母體排斥，而是在母-胎界面免疫系統的調節下成功耐受，這得益于母胎間復雜而精確的免疫平衡機制。母-胎界面由母體蛻膜組織和胎盤滋養層組織共同構成，內含多種免疫活性細胞和免疫因子。他們共同構成的子宮免疫微環境是母體與胎兒免疫調節發揮作用的關鍵場所，能在保證感染防御的同時維持母體對胎兒的免疫耐受平衡。

復發性流產（RSA）指與同一性伴侶連續發生3次及以上的孕28周前的自然流產。但國內外大多數學者認為在發生第2次自然流產后就應予以干預，并告知患者引起重視，因其發生再流產的風險已接近3次流產者。RSA病因復雜，除染色體、內分泌、解剖、感染、自身免疫病等傳統因素之外，仍有50%～60%患者無法找到明確的病因，稱為不明原因的RSA（URSA）[1]，且大多與免疫失衡相關。近年來研究發現，URSA患者體內T淋巴細胞及其亞群較正常妊娠組變化顯著[2]，提示該細胞群參與維持子宮免疫微環境的平衡與穩定，一旦失衡即會造成胎兒種植失敗或流產。見圖1。

圖1 RSA患者T淋巴細胞及其亞群

T淋巴細胞及亞群與RSA之間密切相關，但其導致免疫失衡的致病機制尚不完全明確，故筆者對RSA母體T淋巴細胞變化的研究進展進行綜述，為深入研究其引導的免疫調節在疾病中的作用機制奠定理論基礎，以期探索新的治療方法。

1 Th1/Th2

Th細胞均表達CD4，可以通過分泌多種細胞因子引導人體免疫方向的傾斜。其中Th1細胞以分泌白細胞介素（IL）-2、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子為主，主要介導細胞免疫和局部炎癥反應，通過激活細胞免疫和血管內皮促凝參與妊娠病理過程[3]。Th2細胞分泌以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10為主的細胞因子，主要促進B細胞增殖和抗體生成，介導體液免疫，可抑制Th1細胞的分化和功能[4]，誘導母胎界面免疫耐受的形成，防止過度免疫應答對胚胎著床造成的傷害。早期實驗證明，母胎界面免疫平衡向Th2型細胞因子的偏移是妊娠成功的關鍵[5]，近年來也被各種動物模型與臨床研究證明。與DBA/2雄性小鼠結合的CBA/J雌性小鼠是公認的自然流產小鼠模型，Luo等[6]的酶聯免疫吸附（ELISA）實驗結果證明，RSA組小鼠外周血中Th1/Th2細胞因子比值（IFN-γ/IL-4）明顯高于正常妊娠組。在URSA患者蛻膜中IFN-γ的表達也明顯高于對照組，而IL-4和IL-10的表達相應減低[7]。但近來也有研究顯示，具有Th2型免疫優勢的正常婦女也會反復出現自然流產現象[8]。由此可推測，成功妊娠的維持不單與Th1/Th2的平衡有關，還可能是與其他細胞共同作用的結果。

2 Th17/Treg

IL-6和轉化生長因子（TGF）-β在小鼠CD4+細胞定向分化為Th17細胞的過程中缺一不可，但在缺乏IL-6的條件下，TGF-β將抑制孤核受體γt（RORγt）轉錄活化，通過上調Foxp3的表達而促使細胞向Treg細胞分化[9]。Th17細胞/Treg細胞之間的平衡對機體維持自身穩態是至關重要的。雖然兩者均需要TGF-β因子進行初始分化，而終末分化細胞卻執行相反的功能：Th17細胞分泌促炎性因子IL-17，與多種自身免疫性疾病的發生相關；而Treg細胞分泌IL-10等細胞因子，有抗炎和維持免疫穩態的作用，在妊娠過程中增強母體免疫耐受并防止妊娠母體對胎兒的免疫排斥。研究表明，URSA患者的Treg/Th17和Foxp3/RORγt比值均低于正常對照組[10-11]，提示這一平衡向著Th17細胞的方向偏移可能與URSA的發病機制有關。另一組對照研究根據受試者是否具有多次流產史（即URSA）以及是否懷孕將其分為4組，雖然各組患者外周血IL-10、IL-17水平及Th17/Treg細胞比值均保持穩定，但在母胎界面，懷孕的URSA組蛻膜組織中TGF-β1的mRNA和蛋白水平明顯降低，而IL-6和Th17/Treg比值明顯升高[12]。這一結果表明在反復流產患者的母胎界面，免疫細胞與相關因子的變化程度較外周血中更為明顯，且IL-6在Treg/Th17失衡的誘導中起到一定作用。此外，有學者通過ROC曲線分析將Foxp3與RORγt的mRNA檢測應用于疾病診斷中，發現兩項指標聯合檢測優于單項檢測，能有效提高RSA診斷的特異性和敏感性[13]。

3 Treg細胞

由CD4+細胞分化而來的Treg細胞主要分為兩大類：nTreg以及pTreg或iTreg，后者主要包括Tr1和Th3。nTreg主要由胸腺內自身抗原誘導生成，而pTreg細胞來自外周血，由外來抗原誘導生成。除此之外，體內發揮免疫抑制效應的Treg細胞還有CD8+Treg細胞和NKT細胞等。Treg細胞群對于懷孕成功的重要性已經在人類和動物模型中得到證實，且在RSA患者體內較Th17細胞變化更為顯著，提示其對妊娠結局的影響更為重大[14]。Treg細胞除了可以抑制炎癥、防止母體對胎兒過度免疫外，還被證明在妊娠期間有助于調節母體血管功能，支持正常胎兒和胎盤發育[15]。

3.1 nTreg細胞 nTreg占外周血CD4+T細胞的10%左右，主要指CD4+CD25+Foxp3+Treg。已知在正常妊娠或是流產患者的早孕蛻膜組織中，都是以nTreg細胞為主[16]。在小鼠模型中測得外周血nTreg的數量在懷孕期間會持續增加，并在孕中期達到峰值，隨后下降直到足月達非孕水平[17]，提示nTreg細胞的動態變化與成功妊娠相關。nTreg特征性表達Foxp3和高水平IL-2Rα鏈（CD25），因此有多項試驗通過測定Foxp3和CD25來間接反映nTreg的水平。Salek等[18]的實驗證明，RSA模型小鼠經骨髓間充質干細胞處理后顯著上調Foxp3等Treg相關基因在胎盤和蛻膜中的表達，懷孕小鼠的流產率顯著降低，并恢復至正常水平，提示該條件可能會在母胎界面建立一個免疫耐受的微環境，參與調控母體對胎兒的過度免疫反應。

同樣，在RSA患者體內測得CD4+CD25+Treg的比例和Foxp3蛋白水平等各項含量明顯低于正常妊娠對照組，提示Treg細胞數量的下降可能是URSA的發生機制之一[19]。尤其在排除染色體異常的流產患者中，蛻膜Foxp3+Treg細胞減少更為明顯[20]。最近的1項研究表明，RSA組外周血及蛻膜組織中CD4+CD25bright頻率及CD4+CD25bright/CD4+都顯著低于健康對照組，Logistic回歸分析顯示CD4+CD25bright頻率是流產發生的獨立保護因素[21]。同時該作者還提出外周血CD4+CD25+Treg細胞和IL-10水平對RSA具有較高預測價值，聯合檢測可作為預測既往RSA孕婦再發流產的參考指標[22]。

轉錄因子家族成員Helios是nTreg細胞的特異性標志物，可用以區別nTreg和pTreg[23]。Inada等[20]的試驗證明，在正常妊娠時，蛻膜中Helios-pTreg細胞數量很少，而Helios+效應性Treg細胞的出現率明顯高于外周血，提示效應性Treg細胞可能從外周血選擇性地遷移到蛻膜中發揮作用。而在正常的流產患者中，蛻膜基底層的Foxp3+細胞數量減少，但在頂葉蛻膜沒有減少，這表明Treg細胞在胎兒-母體交界處的遷移失敗可能是導致流產發生的原因。

3.2 pTreg細胞 保守的非編碼序列1（CNS1）是一種Foxp3增強子，只存在于胎盤哺乳動物中，是pTreg細胞發育所必需的。在小鼠模型中可以觀察到，pTreg細胞通過識別父系抗原抑制母胎效應性T細胞激活免疫反應。當CNS1缺陷的雌性小鼠與主要組織相容性復合體（MHC）不匹配的雄性小鼠交配時，pTreg細胞的缺乏會導致胚胎自然流產的增加[24]。在妊娠早期植入pTreg后，流產易感模型小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數量明顯增加，胚胎吸收明顯減少[25]。最近的臨床試驗也顯示，與正常非孕者相比，無流產史的懷孕婦女外周性Treg細胞顯著增加；但在URSA患者中，pTreg細胞數量在懷孕時較低[12]。由此可見，pTreg可能參與并維持由nTreg啟動的免疫耐受狀態，在小鼠和人類的胚胎植入和妊娠中起著重要作用。

3.3 其他Treg細胞 在CD8+T細胞中也存在一類Treg細胞。CD8+Treg具有免疫抑制作用，可識別胎兒抗原和裂解滋養層細胞。正常妊娠時在母胎交界處發揮有限的細胞毒作用，通過多種途徑產生抑制信號，導致滋養層抗原特異性耐受。

NKT細胞共表達T細胞受體和自然殺傷（NK）細胞受體，在不同情況下定量克隆。試驗顯示URSA患者外周血和蛻膜中NKT樣細胞亞群所占比例明顯高于正常妊娠和未妊娠婦女，提示NKT樣細胞在維持正常妊娠中可能起重要作用；同時推斷外周血中CD3+CD56+CD16+NKT樣細胞的檢測可能為評估患者自然流產的風險提供一種潛在工具[26]。除此之外，CD8+Treg和NKT細胞也可以分泌1型和2型細胞因子，協助維持Th1/Th2等的動態平衡[27]。

4 其他細胞

在人類免疫細胞中，Th22分泌IL-22而不表達IL-17、IL-4及IFN-γ，在監控和協調免疫細胞引發炎癥的過程中起特殊作用，但在生殖系統的研究甚少[28]。最近的試驗發現[29]，在RSA患者外周血中，Th22的數量及IL-22濃度都有顯著增高；但也有證據表明，正常成功妊娠者外周血及蛻膜中存在IL-22 mRNA增多的現象[30]，提示IL-22在妊娠的某些階段是造成胎兒移植排斥反應的原因，但在其他階段也可能對懷孕有正向作用，其來源與具體作用及機制有待進一步研究。

CD4+T細胞還可分化為Tfh，通過分泌IL-21等相關因子在Th細胞依賴性B細胞產生抗體的過程中起到關鍵作用。研究表明，該種細胞與RSA疾病相關的主要亞群有CD4+CXCR5+PD-1+CCR7-Tfh和CD4+CXCR5+PD-1+ICOS+Tfh。兩者在RSA患者的蛻膜組織中明顯增多，且后者在自身抗體陽性的RSA患者中增加更明顯[31]。此外，患者外周血中Tfh與IL-21水平的升高也有效證實了此類細胞與RSA疾病的相關性[32]。

還有一些研究者提到了Teff細胞，它是指CD25低表達的CD4+的非抑制性效應性T細胞，與Treg一樣表達Foxp3，可由Treg分化而來，但對免疫耐受起破壞作用。在染色體核型正常的流產病例中，蛻膜組織的Foxp3+Teff細胞增加，母胎界面呈現免疫激活顯性狀態[20]。但在感染、過度炎癥或胎兒發育受到干擾的情況下，Treg能夠分化為Teff的能力可終止妊娠并確保孕產婦生存，可見Teff細胞對于妊娠的調節具有積極意義[33]。

5 不同治療方式對母胎T淋巴細胞的影響

5.1 西醫治療 目前大多采取免疫療法，包括淋巴細胞主動免疫、靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）、脂肪乳、免疫抑制劑和粒細胞集落刺激因子等。研究表明，淋巴細胞治療和IVIG的應用均可提高妊娠成功率。在多次植入失敗的URSA患者中，注射外源淋巴細胞或IVIG可以通過平衡Th1/Th2來促進胚胎植入，還能促進改善Treg的比例[34-35]。近年來有學者提出，使用更為安全經濟的脂肪乳可代替免疫球蛋白降低外周血中的NK細胞含量，且治療效果比較差異無統計學意義[36]。適量免疫抑制劑，如環孢素A可調節免疫因子，誘導免疫耐受，通過改變RSA患者共抑制分子的表達降低Th17細胞的百分比，促進Treg細胞的優勢[37]，但因研究樣本量不足，其安全性和有效性有待進一步研究。

此外，通過給予孕酮和補充維生素D3可以影響身體免疫狀態，同樣對RSA有治療效果。越來越多的臨床試驗證據表明，孕酮對反復流產或早產風險高的婦女有效[38]。在1項孕激素聯合絨毛膜促性素治療URSA的隨機對照試驗中，地屈孕酮片組和黃體酮組患者的 IL-4、IL-10、Treg/CD4+均升高，IL-6、IL-17、INF-γ、Th17/Treg均降低，且地屈孕酮片組流產率較低，足月分娩率更高。提示孕激素聯合絨毛膜促性素可通過調節患者T淋巴細胞因子及炎癥因子水平，促進母胎平衡，提高保胎率[39]。還有些數據表明[40]，給予外源性雌激素治療的小鼠Foxp3的表達增強，在懷孕期間Treg功能增加。維生素D3治療也可通過影響外周血Th1/Th2、Th17/Treg比值，增強免疫耐受，從而改善妊娠結局[41]。

5.2 中醫治療 RSA在中醫屬“數墮胎”“滑胎”等范疇，治療應以補腎健脾為主，兼補益氣血。中醫藥治療RSA臨證時通過辨證論治，可靈活運用經典方、經驗方，并隨癥加減，在多項臨床試驗中取得顯著成效。實驗證明中藥自擬固胎煎（由經典名方壽胎丸化載而來）可通過上調小鼠外周血IL-10、TGF-β1的表達水平，下調IL-6、IL-17的表達水平調節母胎免疫[42]，起到補腎健脾安胎的功效。此外，減味壽胎丸[43]、補腎固沖方[44]等均可通過提高患者Treg細胞百分率，下調Th17細胞及其分泌的免疫因子含量，降低胚胎吸收率。

妊娠是一個復雜的生理過程，為使胎兒不受母體免疫系統排斥，母胎界面的T淋巴細胞亞群和免疫分子充分發揮各自職能，對耐受平衡進行復雜而精細的調控。近年來在發現部分RSA患者同樣具有Th2型免疫優勢后，學者們開始將研究重點從經典的Th1/Th2失衡理論轉移到Th17/Treg上來，尤其是各類Treg細胞在外周與母胎間的分布和變化，成為了生殖醫學領域的研究熱點。但當下對于疾病的大多研究仍集中在通過測定細胞因子含量和標志性基因，對比正常妊娠組與RSA患者T淋巴細胞各亞群數量級的差異上。研究結果往往只能說明該細胞群與疾病的免疫病理因素相關，而每種細胞是如何調節抗原免疫耐受形成的機制尚不清楚，他們在RSA中究竟如何發揮作用仍待研究。目前，評估URSA患者的細胞因子功能狀態及免疫細胞含量可能對于制定合理的治療方案具有一定指導意義，但仍需大規模臨床研究來支持針對細胞因子治療的可行性及評估獲益風險。筆者綜述匯總了既往免疫細胞的相關研究，為深入研究免疫調節在RSA中的作用機制提供理論參考，以探索新的免疫學診斷和治療方法改善妊娠結局。