提取工藝對檸檬多糖得率及理化特征的影響

高 銘，陳瑞戰，吳 靜，白春龍，孫 惠，李冬雪，吳文靜

(長春師范大學化學學院，吉林 長春 130032)

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，廣泛存在于動物細胞膜和植物、微生物的細胞壁中，是構成生命的四大基本物質之一，常與蛋白質結合參與細胞的調節和分化，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌[1]、免疫調節、降血糖、降血脂[2]、抗病毒[3]、抗疲勞[4]、抗炎、神經保護等藥理活性[5]，幾乎沒有毒副作用，這使得它具有非常大的潛力，應用于藥品、功能食品、化妝品、飲料等領域。但多糖常與蛋白質、脂質、花青素等化合物結合，導致提取效率低、分離純化難，且易引起結構變化[6]。此外，不同的提取技術和工藝參數不僅會影響多糖的得率，還會引起多糖理化性質的改變和生物活性的降低。因此，比較不同提取工藝對檸檬多糖(LPs)得率、理化性質的影響對該多糖的開發利用具有極為重要的意義。

檸檬(CitruslimonL.)為雙子葉蕓香科柑橘屬常綠小喬木植物的果實，是藥食兩用水果。檸檬中富含果膠多糖、檸檬酸、橙皮苷、維生素、花青素等活性成分，具有抗氧化、抗癌[7]、抗炎[8]、抗增殖、抗菌、抗糖尿病和抗病毒等活性，廣泛應用于冰糕、飲料、果醬、果凍、糖果等生產[9]。

本研究采用六種不同工藝提取LPs，并通過DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換和Sephadex G-150凝膠柱層析分離和純化多糖組分。利用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、紫外可見光譜(UV)等比較多糖的理化性質，為該多糖在醫藥、功能食品、化妝品等領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬產自中國四川省資陽市安岳縣，經過60℃減壓干燥，粉碎，石油醚回流脫脂和脫色，乙醇(φ=95%)回流去除小分子，風干得到預處理樣品。

N-1100旋轉蒸發儀(日本愛郎儀器有限公司)；X1R高速離心機(德國Heraeus Multifuge)；FD-1E-50型冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)。

1.2 多糖的提取及分離

LPs的提取、分離、純化工藝流程如圖1所示。

圖1 LPs的提取、分離、純化工藝流程

1.2.1 熱回流提取(HRE)

準確稱取2 g預處理樣品，加入180 mL蒸餾水，在80℃的條件下提取2.5 h。提取物在轉速5 000 r/min離心20 min，上清液于50℃下減壓濃縮至原體積的1/5，加入4倍體積的95%乙醇，在4℃條件下醇沉12 h；混合物在5 000 r/min離心15 min，收集沉淀用蒸餾水溶解，Sevage法脫蛋白，用分子量3 500 Da的透析袋流水透析36 h，冷凍干燥得到HRE多糖(LPHR)。

1.2.2 超聲輔助提取(UAE)

采用SL-2010N超聲裝置(南京順流儀器有限公司)，在頻率為20 kHz、溫度45℃、蒸餾水與預處理樣品比為80 mL/g、超聲功率675 W、超聲時間40 min條件下超聲提取。提取后離心、濃縮、醇沉、脫蛋白和透析步驟與HRE相同，凍干得到UAE多糖(LPUA)。

1.2.3 微波輔助提取(MAE)

采用MAS-I 微波提取儀(上海新儀微波化學科技有限公司)，按提取溫度70℃、液料比60 mL/g，微波功率200 W、提取50 min條件進行微波提取。提取混合物后處理方法與HRE相同，凍干得到MAE多糖(LPMA)。

1.2.4 復合酶輔助提取(EAE)

本項目使用的混凝土平倉推土機有兩類，分別為D31p-18A和D65P-8，二者均產自日本；所使用的倉面碾壓設備有三類，包括BW200、BW202AD和BW75S，三者均產自德國。檢測設備有DN-40中子儀和TS-600VC值測量儀。

干燥的預處理樣品2 g，加入140 mL復合酶溶液(果膠酶(w=0.2%)、纖維素酶(w=0.2%)、木瓜蛋白酶(w=0.1%)，pH為4.5)、25℃條件下浸泡12 h，然后在60℃下復合酶輔助提取2 h。復合酶滅活后(100℃、滅活10 min)，提取混合物后處理方法與HRE相同，凍干得到EAE多糖(LPEA)。

1.2.5 復合酶輔助超聲提取(UEE)

干燥的預處理樣品2 g，加入140 mL復合酶溶液(w=0.5%)(果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶的活性比為2∶2∶1，pH為4.5)，于25℃浸泡12 h。隨后，使用SL-2010N超聲裝置，在超聲功率375 W、溫度40℃、超聲時間40 min、頻率20 kHz進行提取。提取混合物在100℃下滅活復合酶10 min，得到的溶液處理方法與HRE相同，真空冷凍干燥得到UEE多糖(LPUE)。

1.2.6 復合酶輔助微波提取(MEE)

干燥的預處理樣品2 g，加入140 mL復合酶溶液(w=0.5%)(果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶的活性比為2∶2∶1，pH為4.5)，在25℃下浸泡12 h。然后使用MAS-I微波提取儀(微波功率400 W、溫度50℃、提取時間40 min)進行復合酶輔助微波提取。提取混合物酶滅活后，提取液與HRE處理相同，冷凍干燥得到MEE多糖(LPME)。

1.3 LPs的分離純化

將50 mg LPUE和LPME溶于50 mL蒸餾水中，過0.45 μm濾膜。濾液加入DEAE-Sepharose CL-6B陰離子交換柱(2.5 cm×50 cm)，用 0、0.5、1 mol/L NaCl梯度洗脫，流速0.5 mL/min。洗脫液用全自動收集器(5 mL/管)收集。用苯酚-硫酸法在490 nm處測定各管中吸光度值，繪制出吸光度值與管數的洗脫曲線。將每個主要峰的洗脫液匯集、透析、濃縮后上Sephadex G-150柱(1.5 cm×50 cm)進一步純化，洗脫液為0.1 mol/L NH4HCO3、流速0.6 mL/min，收集洗脫液，測定吸光度值，繪制洗脫曲線，合并主要峰洗脫液、使用透析袋(8 000～14 000 Da)透析、凍干，得到四個純化多糖組分(LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2)。

1.4 LPs的理化特征分析

1.4.1 LPs的化學成分分析

采用苯酚-硫酸法(Glc為標準品)[10]、考馬斯亮藍法(牛血清白蛋白為標準品)[11]、硫酸-卡唑法(葡萄糖醛酸為標準品)[12]、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法(蘆丁為標準品)[13]、福林-喬卡爾法(沒食子酸為標準品)[14]，測定LPs中糖、蛋白質、糖醛酸、總黃酮和多酚含量。

將干樣品(1 mg)研磨并與干KBr(100 mg)混合，壓成薄膜，使用iS50 FT-IR分光光度計(美國Thermo公司)在4 000～400 cm-1范圍內檢測。樣品(1 mg/mL)的紫外光譜用Cary 60紫外可見分光光度計(美國安捷倫)在200～400 nm波長范圍內檢測。

2 結果與討論

2.1 提取方法對LPs得率的影響

六種不同的提取工藝提取LPs，各工藝的得率和工藝參數見表1，LPs的得率按HRE、MAE、UAE、EAE、MEE、UEE的順序增高。HRE是最傳統的提取方法，主要依靠較高的溫度來提高LPs的溶解和傳質速率、增加溶劑的擴散速率，從而達到提高LPs得率的目的。根據單因素實驗結果，在液料比為90 mL/g、提取時間150 min、提取溫度80℃的條件下，LPHR的得率為(4.20±1.18)%。

EAE是一種新型有效的提取技術，通過對細胞壁的解聚， 提高生物活性化合物的可提取性[15]。但由于天然植物材料的獨特性質，適宜的水解酶的種類和配比各不相同，需要優化考察。首先通過正交實驗確定復合酶的適宜配比，纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的活性比為10∶30∶3。在該復合酶配比和表1給出的最佳EAE條件下，LPEA的提取率為(12.70±1.05)%，是LPHR的3.02倍，表明EAE能夠有效提高多糖得率[16]。

表1 不同提取工藝和參數對LPs的影響

LPUA的得率和UAE條件見表1。UAE提取的LPUA得率(8.82±1.04)%是HRE的2.1倍。這一結果證明，UAE在最佳條件下可以顯著提高LPUA的得率，這主要是由于超聲波可以導致細胞壁破裂，增加多糖的溶解和傳質，從而提高多糖得率[17]。然而，當這些參數超過表1給出的范圍時，可能會導致多糖降解，從而導致得率下降。這種現象可能是由于糖苷鍵斷裂，導致多糖的物理化學和功能特性發生一系列變化，證明UAE也是一種有用的多糖提取和修飾方法，最佳的工藝參數需要優化。

通過正交實驗確定的MAE工藝條件為液料比60 mL/g、提取時間50 min、提取溫度70℃、微波功率200 W，可使LPMA得率達到(6.27±1.16)%。在此條件下，LPMA的得率比LPHR提高了49.29%，其原因可能是微波輻射導致植物細胞壁基質疏松甚至破裂，增加了溶劑的滲透擴散速度，促進了多糖的溶解擴散，提高了LPMA得率[18]。

在上述實驗的基礎上，通過單因素和響應面優化實驗進一步探討復合酶與UEE和MEE的協同作用。在復合酶(w=0.5%)(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的活性比為10∶30∶3)、復合酶溶液與原料比為70 mL/g、超聲時間40 min、超聲溫度40℃、超聲功率375 W時，LPUE的提取率最高(14.41±1.21)%。復合酶(w=0.5%)(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的活性比為10∶30∶3)、復合酶溶液與原料比70 mL/g、微波時間40 min、提取溫度50℃、微波功率300 W時，LPME的提取率最高(13.46±1.53)%。與單一EAE、UAE和MAE相比，UEE和MEE均能提高產率，說明復合酶與超聲、微波組合具有顯著的協同作用。這可能是由于超聲波和微波破壞細胞壁，加速細胞內多糖的釋放，并參與調節復合酶活性，使多糖得率大幅提高，這與LARSEN等[19]報道的在某些實驗條件下，超聲和酶的聯合應用可以增加植物多糖的提取并促進聚合物的降解的結果一致，說明超聲、微波和復合酶聯合使用不僅能提高多糖的提取率，還能調節多糖的理化特性和功能特性，是高效提取和修飾植物多糖的有效方法。

2.2 LPUE和LPME的純化

提取后，采用DEAE-Sepharose CL-6B色譜柱對LPUE和LPME進行分離純化。如圖2(a)所示，用H2O和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫分離出兩個組分，分別命名為LPUE-1s和LPUE-2s。LPME的洗脫曲線如圖2(b)所示，得到兩個主要組分(LPME-1s和LPME-2s)，其中LPME-2s為主要組分，表明LPME中包含兩種多糖。上述四個組分上Sephadex G-150凝膠柱進一步純化，得到LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2四個純化多糖，其得率分別為(23.14±1.58)%、(14.70±1.08)%、(22.14±11.67)%和(23.25±2.01)%(表2)。

(a) (b)圖2 LPUE、LPME在CL-6B凝膠柱上的洗脫曲線

2.3 LPs的理化性質

不同的提取工藝可能導致分子鏈水解斷裂和分子間氫鍵斷裂，從而改變多糖的理化性質和生物活性[20]。LPs的理化性質測定結果見表2，表明不同提取工藝得到的粗多糖理化性質存在明顯差異。LPHR、LPEA、LPUA、LPUE、LPMA和LPME的PC分別為(2.32±0.22)%、(1.91±0.16)%、(2.24±0.20)%、(2.29±0.78)%、(2.01±0.15)%和(1.88±0.16)%，說明這些LPs均含有一定量的蛋白質。HRE的PC最高，MEE最低，LPHR的PC值比LPME提高了23.4%。與此同時，LPEA的PC值低于其他四種樣品，說明復合酶水解比其他方法能更有效降低提取多糖的PC值，這可能是由于蛋白質在酶解過程中的降解，而微波通過微波場與偶極子分子和離子的分子相互作用，可以迅速提高組織細胞內部的溫度和壓力，使組織破裂，溶解內部成分。在這一過程中，還可能引起生物大分子(如蛋白質和多糖)的降解，這些綜合效應可能導致LPME的PC降低。LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2中PC含量分別為(1.43±0.09)% 、(1.06±0.05)%、(1.19±0.07)%和(0.93±0.04)%，說明四種純化多糖中也含有一定量的蛋白質，但其含量明顯低于其粗多糖。這一結果表明，在Sevage法脫蛋白過程中，純化多糖中部分游離蛋白被去除，而剩余的蛋白質可能通過共價鍵或非共價鍵與多糖形成穩定的復合物[21]。

表2 不同工藝提取檸檬多糖的理化性質

LPs的UAC按照LPME(31.89±2.21)%>LPUE(27.37±2.08)%>LPEA(25.88±1.06)%>LPMA(19.66±1.14)%>LPHR(19.16±1.22)%>LPUA(18.71±1.04)%的順序遞減，說明不同提取方法提取的UAC存在顯著差異。在所有提取的LPs中，LPME的UAC最高，證明微波和復合酶的協同作用可以提高多糖中的UAC，這可能是因為微波輻射會增加偶極子旋轉，導致熱量快速產生，使細胞破裂，誘導聚半乳糖酸鏈水解，UAC增加。同時LPUE和LPME的純化多糖的LPUE-1和LPME-1明顯高于其粗多糖，這可能是純化后多糖的純度增加以及多糖結構差異所致；同樣，MEE提取的純化多糖的UAC略高于UEE提取的純化多糖，這與兩種提取方法得到的粗多糖一致。

LPs中的TFC和TPC分別在(0.45±0.03)%～(1.46±0.13)%和(0.14±0.01)%～(0.42±0.04)%，表明不同提取方法的LPs及純化多糖均含有一定數量的黃酮類和多酚類物質。LPME的TFC和TPC最高，分別為(1.46±0.13)%和(0.42±0.04)%，說明MEE可有效增加LPME的TFC和TPC。這可能是由于在微波萃取過程中，微波萃取器內腔溫度和壓力的迅速升高破壞了物質細胞，將內部的黃酮和多酚釋放到提取溶劑中，提高了LPs的TFC和TPC。

但純化多糖中的類黃酮和多酚含量明顯低于粗多糖，這可能與多糖在乙醇沉淀、透析等純化過程中游離類黃酮和多酚被去除有關。特別是LPUE-1和LPUE-2中較低的TPC也可能是由于高強度超聲對多酚結構的破壞。但從表2可以看出，四種純化多糖中仍含有一定數量的類黃酮和多酚，這可能是由于這些化合物與多糖形成了穩定的復合物，這與報道的結果[21]一致。上述結果表明，選擇合適的提取方法和工藝參數不僅可以提高多糖的得率，而且還可以改善其理化性質，從而導致其功能特性的變化。

2.4 FT-IR光譜分析

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)是表征多糖中有機基團的有力工具。FT-IR光譜(圖3)顯示，四種純化多糖均有強而寬的吸收峰，這是由于羧酸的游離/鍵合羥基的分子內或分子間氫鍵的O—H伸縮振動，表明 LPUE和LPME中存在—OH[22]。四種多糖均未發現新的結構峰，表明在分離純化過程中未產生新的官能團[23]。純化多糖的FT-IR光譜在3 300～3 500 cm-1之間顯示出寬范圍的強吸收區，表明PMP結構中存在—OH[24]，該吸收峰與羧酸的游離/鍵合羥基的分子間和分子內氫鍵的振動模式有關[25]。2 920 cm-1左右是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動，是多糖的特征吸收峰[26]。在1 739 cm-1和1 651 cm-1處的兩個吸收峰分別表示酯羰基(C═O)基團和羧酸根離子伸縮帶(COO-)，表明檸檬多糖中存在羰基[27]。由于1 739 cm-1處的吸光度高于1 651 cm-1處的吸光度，這是低甲氧基果膠多糖的特征[27]。1 739 cm-1附近的吸收表明存在糖醛酸[28]。LPUE-1和LPME-1中糖醛酸含量相近，LPME-2中約1 730 cm-1處的峰略高于LPUE-2，說明LPME-2中糖醛酸含量高于LPUE-2，這與UAC測定結果一致。此外，蛋白質氨基帶也可能在1 636 cm-1處出現吸收，表明LPs中存在蛋白質[29]。1 413 cm-1是C—H剪切振動的特征吸收峰[30]。而622 cm-1處的吸收峰為O—H的伸縮振動，揭示了LPUE-1、LPUE-2、LPME-1和LPME-2中酚類化合物的存在[31]。UEE和MEE處理并未改變LPs在3 400 cm-1、2 920 cm-1和1 621 cm-1附近的主要吸收峰[32]。結果表明，超聲波處理對糖苷鍵和糖環的結構沒有明顯影響，但不同提取方法所得產物的峰強存在一定差異，說明不同工藝會影響多糖中的PC、UAC。

A—LPUE-2，B— LPUE-1，C—LPME-2，D—LPME-1圖3 LPUE-1、LPME-1、LPUE-2和LPME-2的FT-IR光譜

2.5 紫外光譜分析

用紫外分光光度計測量260～280 nm處的吸收峰，以確定樣品是否含有蛋白質[33]。研究表明，不僅芳香族氨基酸或蛋白質在250～290 nm處有吸收峰，帶有羰基的化合物在280 nm附近也有弱吸收[34-35]。四種檸檬多糖的紫外可見光譜見圖4。最大紫外吸收值在200 nm處，證明多糖的紫外吸收處于末端，在260～280 nm附近有吸收峰，說明多糖含有蛋白質、多酚和糖醛酸(表2)。如圖4所示，LPUE-2和LPME-2在260 nm附近沒有明顯的峰，說明兩種LPs的蛋白質含量較低。圖中LPUE-1的吸收峰明顯高于其他三種純化多糖，說明超聲波在UV-Vis光譜中，280 nm附近的LPUE-1吸收強度增加[36]。四種多糖經分離純化后仍含有一定量的蛋白質，其原因可能是蛋白質與多糖形成穩定的復合物，這些復合物的形成可能會影響其生物活性[37]。

(a)LPUE-1

(b)LPUE-2

(c)LPME-1

(d)LPME-2

3 結論

不同的提取工藝對LPs得率和理化特征有顯著影響。UEE和MEE的多糖LPUE和LPME得率、UAC、TPC和TFC均高于其他工藝得到的LPs組分。分離、純化后四種LPs多糖組分的PC、TPC和TFC均低于分離前的LPs多糖組分。紫外光譜分析表明LPUE-1和LPME-1的蛋白質含量高于其LPUE-2和LPME-2。紅外光譜證明所有多糖官能團都具有多糖的一般特征吸收峰。研究表明，UEE和MEE是兩種高效的植物多糖提取和改性技術。LPs結構和功能特性有待進一步研究。