早熟棉轉基因研究進展

劉 圓，肖娟麗，張安紅，2，王志安，趙戰勝，羅曉麗，2*

(1.山西農業大學棉花研究所，山西運城 044000；2.棉花種質資源利用與分子設計育種山西省重點實驗室，山西運城 044000；3.新疆生產建設兵團第六師農業科學研究所，新疆五家渠 831300)

早熟棉是適宜緩解當前糧棉爭地、植棉面積逐漸減少現狀的一種棉花類型，其最主要的特點是生育期短、適于晚春播、初夏播或夏播，可以與冬小麥、油菜等冬季作物實現糧棉一年兩熟，提高復種指數，在增加糧食產量、保證糧食安全的同時，確保棉花的種植面積及產量，為國家農業戰略的實施提供堅實的基礎[1-2]。在春季氣溫低、秋季氣溫下降快、光熱條件差、降水少的西北內陸地區，丘陵、山區較多且無霜期較短的華北地區，如遼寧、新疆、甘肅、內蒙古等地種植早熟棉還可以提高棉花的霜前花率，改善棉花品質[3]。尤其是新疆位于溫帶大陸性氣候區，夏季降水少，多晴天，晝夜溫差大；緯度較高，夏季白晝較長，光照充足；位于塔里木盆地邊緣山麓地帶，高山冰雪融水豐富，灌溉便利；多沙質土壤，透氣性好，有利于棉花生長；收獲季節多晴朗天氣，有利于棉花采摘；冬季氣溫低，有利于殺死棉花病蟲害。這些得天獨厚的光、熱資源等便利條件，使得新疆棉花以色澤潔白、纖維品質好而深受棉紡織企業和消費者青睞。自20世紀90年代中期以來，以新疆為主產區的西北內陸棉區成為全國優勢產區，據國家統計局數據，2015年以來，新疆棉花播種面積常年占全國播種面積的60%以上，2019年達到76%，2020年新疆棉花產量占全國總產量的87.3%[4-6]。新疆南北疆共有37個主要棉地，其中北疆21個以種植早熟棉品種為主，南疆16個以種植中早熟棉品種為主。

由于新疆地處西北內陸，常年降雨較少，并且耕地普遍有不同程度的沙化，與之伴隨而來的鹽堿化和次生鹽堿化現象較為嚴重；此外常年連作造成了病蟲害的發生和棉田雜草危害日趨嚴重，極大地限制了新疆棉花種植業的發展。因此，生產上急需高產優質，同時兼具抗旱、耐鹽堿和抗病蟲害的早熟棉花新品種。而通過常規的育種手段在短時間內是很難實現的。因此，培育優良的早熟棉品種，對優化種植結構，提高種植效益具有重要的意義。隨著生物技術的快速發展，通過基因工程手段解決上述問題成為了可能。例如，我國在轉基因棉花的研究中已經取得了較大的成績，轉基因抗蟲棉花已經得到大規模的應用[7-14]。轉基因棉花大部分為農桿菌介導轉化，這就離不開棉花的組織培養和體細胞胚胎發生，但棉花體細胞胚胎發生受基因型限制[15-16]，阻礙了生物技術在棉花遺傳改良中的廣泛應用和迅速發展。

早熟棉的體細胞胚胎發生受基因型限制尤其嚴重，目前國內轉基因棉花的受體親本大部分是生育期在180 d以上的中熟棉，具有目標性狀的轉基因中熟棉和優良早熟棉進行雜交轉育，存在花期不遇的現象，如通過栽培調整花期后雜交轉育成功，則后代出現生育期延長不能在早熟棉區種植，這種現象阻礙了生物技術在早熟棉遺傳改良中的廣泛應用和迅速發展，在棉花轉基因工程的研究中，除了分離、克隆目標基因，構建高效表達載體等技術外，從適用于大田生產上廣泛使用的早熟棉中篩選體細胞能夠再生的品種，通過組織培養技術和常規育種技術篩選出體細胞胚胎高頻再生的受體材料，建立一套廣為適用的早熟棉組織培養快速再生體系是早熟棉轉基因成功的關鍵因素，因此相關學者在早熟棉體細胞再生方面做了大量的研究工作，并取得了可喜的成績。但是能夠體細胞再生的早熟棉種質資源很少，所以拓展早熟棉花再生基因型、篩選高頻再生品(種)系或株系，對于早熟棉花基因工程具有重要意義。

該研究對我國近年來早熟棉體細胞再生和早熟棉轉基因研究的進展做了總結，遴選出了能夠候選為轉化受體的早熟棉優良品種，并對早熟棉轉基因研究提出了展望，以期為創制抗病蟲、抗除草劑、抗旱和耐鹽堿的早熟棉新種質奠定基礎。

1 國內早熟棉體細胞再生研究進展

自張寶紅等[17]將泗棉3號進行組織培養，獲得了具有高頻胚胎發生的愈傷組織、胚狀體和小植株后，朱生偉等[18]以陸地棉(GossypiumhirsutumL.)新疆推廣品種“新陸早4號”進行體細胞再生研究并在6～7個月獲得了再生植株。于婭等[19]以陸地棉“中棉所24”為材料進行了全固體體細胞培養，獲得了愈傷組織和再生植株。王芳等[20]對新疆2個陸地棉品種新陸早1號、新陸早7號的胚狀體發生及植株再生進行研究，結果表明胚狀體發生、萌發、成苗各階段，品種間存在明顯差異。正常植株率最高分別達65.7%、85.7%。周小鳳等[21]以15個新疆主栽優良品種(系)以及2個對照品種ZY-1和Y668為研究對象，利用下胚軸做外植體進行胚胎發生能力的比較研究，篩選出5個能夠胚胎發生的基因型，即新陸早12、新陸早17、新陸早22、新陸早32和新陸早33，其中新陸早32和新陸早33能在3個月左右分化，且分化率較高，可達90%左右，具備作為棉花優良遺傳轉化受體的基本特征。

陳天子等[22]以新疆4個主栽棉花品種新陸中20、新陸早24、新陸早 33和 03298為材料，通過不同濃度的激素組合成功地誘導獲得了體細胞胚并在6～8個月內獲得了再生植株。嚴勇亮等[23]以新疆棉區的新陸中15號、新陸中18號、系9、黃河流域棉區的中棉所35號、中棉所44號及對照品種柯字312為研究對象，比較新疆和黃河流域2個生態區棉花品種的體細胞再生能力，優化棉花體細胞胚胎發生的相關條件參數，除新陸中18號外其他5個獲得了再生植株，建立高效棉花體細胞再生體系，并且得出新疆棉區和黃河流域棉花品種的植株再生潛力沒有明顯差別，新陸中15號的愈傷組織分化率及胚胎萌發率都比較高，具備作為棉花優良遺傳轉化受體的基本特征，但新疆棉花品種細胞胚胎發生所需的時間長的結論。羅曉麗等[24]以8個早熟或特早熟棉花為材料，通過不同激素組合(1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L KT、0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)誘導其愈傷組織，成功使晉棉5號、中棉所27號和遼棉10號3個早熟棉品種在5～7個月內通過體細胞胚胎分化獲得再生小苗。周晶等[25]以新疆陸地棉主栽品種新陸早19號和新陸早23號下胚軸為外植體，通過對再生體系的研究，首次獲得了胚性愈傷組織并在6～8個月獲得了大量再生植株。劉麗等[26]以新疆主栽品種新陸早32號、33號和對照YZ1為研究材料，通過不同濃度的激素組合成功誘導獲得了體細胞胚，并在8個月內都成功得到再生苗。焦天奇等[27]以新陸早33號為對照研究新疆主栽品種新陸早42號的體細胞胚胎發生，新陸早42號在140 d內獲得了有根系發育良好的能嫁接植株(株高7～8 cm)。李鵬飛等[28]以新疆棉區主栽品種新陸早33 號和新彩棉7 號為試驗材料，比較不同激素組合對二者體細胞胚胎發生過程的影響，在6個月內獲得再生植株。李有忠等[29]以新疆主栽早熟棉品種新陸早13號、新陸早26號、新陸早33號為試材，通過不同質量濃度的激素組合成功誘導并獲得體細胞胚，在8個月內都能成功獲得再生苗。馬盼盼等[30]以模式品種Coker312為對照研究新疆主栽陸地棉品種新陸早33號的體細胞胚胎發生和植株再生，新陸早33號在180 d 獲得根系發育良好的再生幼苗，而 Coker312 完成這一過程則需要210 d。葛書婭等[31]利用(0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)的激素組合成功建立了陸地棉新陸早45號的胚胎發生再生體系，150 d左右獲得了再生植株。

根據國內早熟棉體細胞再生和早熟棉轉基因研究現狀文獻報道，以及筆者對早熟棉體細胞胚胎發生和植株再生體系建立[24]所做的研究，總結出大田生產上廣泛使用并能夠進行體細胞再生的早熟棉品種有新陸早1號、4號、7號、12號、13號、17號、19號、22號、23號、32號、33號、45號，中棉所16號、24號，泗棉3號，晉棉5號，遼棉10號等；中早熟棉品種能夠進行體細胞再生的有新陸中15號、20號、24號、中12、中13、中17、中19、中27、中35、中44、冀棉7、冀棉11、冀棉14、冀棉19、冀棉20、冀棉27、晉棉7、晉棉12、魯棉1號、魯棉2號、魯棉6號、蘇棉12號等。其中獲得體細胞再生植株重復報道的有新陸早33號(7次)、新陸早1號(2次)、新陸早32號(2次)、泗棉3號(2次)。

2 國內早熟棉轉基因研究進展

隨著轉基因棉花在國內大面積的種植，在早熟棉體細胞胚胎發生和植株再生研究的基礎上，以早熟棉為受體的早熟棉轉基因研究也開展起來。自王偉等[32]以新疆陸地棉栽培品種新陸早1號為轉化受體，通過根農桿菌介導法成功地將修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑(CPTI)基因導入新陸早1號并在7～8個月獲得轉基因再生植株后，有關早熟棉轉基因的研究便一直備受相關科研人員的重視。吳慎杰等[33]以陸地棉泗棉3號的下胚軸為外植體，建立了高效的轉化體系，得到了大量的轉基因植株。中國農業科學院棉花研究所棉花生物學重點實驗室以早熟棉中棉所24號為受體獲得大量的轉基因棉花，其中將擬南芥過表達基因AtCIPK23、AtAKT1和AtCBL1轉入早熟棉中棉所24號中，張斌等[34]對轉基因棉花苗期耐低鉀的差異及機制進行了研究。孟顥光[35]利用根癌農桿菌介導法，將雙價抗真菌病基因幾丁質酶基因(Chitinase)和β-1，3-葡聚糖酶基因(Glucanase)導入中棉所 24 中，獲得了抗性穩定的抗病植株；張興華等[36]對轉雙價抗病基因(Chi+Glu)棉抗枯黃萎病競爭能力進行了研究；劉小玲等[37]對轉RRM2和ACO2-E6基因棉花冠層特征和光合特性與產量形成的關系進行了分析；楊作仁[38]利用T-DNA 激活標簽轉化中棉所 24號所獲得的pagoda1 突變體為研究對象，對棉花T-DNA激活標簽突變體 pagoda1 的分子機制進行研究并應用。山西農業大學棉花研究所的李靜等[39]為拓展可再生陸地棉的基因型，利用轉基因技術直接改良已有的優良早熟棉品種，設置不同濃度的2，4-D和激動素(KT)4種組合進行誘導，用6～8個月成功獲得體細胞胚和再生植株，構建早熟棉品種“中棉所16”再生體系，并利用該體系將EDT1抗旱耐鹽基因成功導入“中棉所16”基因組，獲得了轉基因植株。利用早熟棉體細胞胚胎發生進行外源基因轉化并獲得成功的有新陸早1號、中棉所24號、泗棉3號、中棉所16號等4個棉花品種。中國農業科學院棉花研究所分子遺傳改良實驗室以中棉所24號作為早熟棉轉基因受體的模式品種建立了規?；D基因技術體系，在早熟棉種質創制和功能基因驗證方面發揮了重要的作用。但是目前還沒有早熟棉直接作為受體轉化選育的轉基因早熟棉品種用于生產。

以上早熟棉品種經體細胞再生或作為轉基因受體的重復驗證均獲得再生植株或轉基因再生植株，可根據不同早熟棉種植區的需要選擇作為轉基因受體的優良品種。其他已報道具備體細胞再生的早熟棉和中早熟棉作為拓展早熟棉花再生基因型，經過體細胞再生試驗、篩選高頻再生品(種)系或株系可作為備用轉化受體，這對于早熟棉花基因工程具有重要意義。

3 早熟棉轉基因研究建議

農桿菌介導的早熟棉高效轉化體系建立的關鍵是以高頻(50%以上)體細胞胚胎發生和植株再生的優良早熟棉品種受體為基礎，以高效的轉化率(50%以上)為保障，為廣泛高效的開展早熟棉轉基因研究，創制生產上急需的早熟棉種質為目的。轉基因早熟棉研究應將以下2點作為重點。

3.1 早熟棉高頻再生純合系的篩選以該研究闡述的能夠體細胞再生且品質優良的(中)早熟棉品種為候選品種，如新陸早33號、新陸早32號、新陸早1號、新陸早45號、中棉所16號、中棉所24號、泗棉3號等，以這些品種的脫絨種子為材料，根據文獻已報道的資料和筆者長期研究總結得出的結果[24，40]，調整早熟棉體細胞再生各階段所需培養基組成成分，培養時間及繼代次數，根據早熟棉生長發育特點調整組織培養條件。

參照吳家和等[41]的方法并做適當改進進行早熟棉高頻再生純合系篩選，將生長健壯的無菌苗(30株)分株進行下胚軸組織培養，選擇不同單株10個克隆的可育再生單株，收獲T0自交單鈴種子。T0種子的無菌苗(T1)第2次組培，收獲胚胎發生和再生周期短(150 d)的T0 株系的再生單株自交T1種子。種植T1種子，收獲農藝性狀優良的T2自交株行種子并擴繁，獲得早熟棉高頻再生純合系轉化親本。高頻再生純合系轉化親本的獲得可將轉基因過程縮短到6～8個月，篩選流程如圖1所示。

圖1 早熟棉高頻再生純合系篩選流程

3.2 建立農桿菌介導的早熟棉高效轉化體系根據已有研究與實踐結果[42-43]，要建立早熟棉高效的轉化體系必須以提高菌株活力降低轉化材料的泛菌率和降低轉基因棉花畸形苗和不育率為前提。

3.2.1提高菌株活力降低轉化材料的泛菌率。分別挑取攜帶目的基因的農桿菌菌落接種于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平LB液體培養基中，菌株活力旺盛的在28 ℃振蕩培養24 h后OD600值可達到0.5～0.7，未達到此標準的菌株不能用作轉化。農桿菌介導的棉花轉基因體系要隨時檢測菌株的活力。將培養至對數生長期的農桿菌菌液用LB稀釋100倍后加入50 mg/L的乙酰丁香酮(AS)，26～28 ℃振蕩培養(180～200 r/min)0.5～1.0 h浸染棉花無菌苗下胚軸外植體切段8～10 min，浸染后吸干外植體上的菌液、低溫共培(21 ℃)48 h。 經共培養后的下胚軸切段轉入愈傷組織誘導篩選培養基中，在常規條件下[棉花遺傳轉化的組織培養條件均為：溫度(28±2)℃，光照長度12 h/d，光照強度2 000 lx],先暗培養1個月，然后光培養1個月后再次轉入誘導篩選培養基中，光培養1個月進行二次誘導篩選，愈傷組織直徑達到0.5～1.0 cm，未誘導出愈傷組織的下胚軸切段淘汰。

通過浸染液的稀釋、浸染后吸干外植體上的菌液、低溫共培、暗培養和二次篩選，并嚴格繼代操作規范等可將外植體及愈傷的泛菌現象降低到5%以下，菌株活力的增強可使轉化率提高到50%以上。

3.2.2降低轉基因棉花畸形苗和不育率。通過二次篩選誘導培養后將愈傷組織置入增殖培養基時即時抽掉激素；縮短胚性愈傷組織繼代培養時間(10～15 d)至胚狀體出現；分化的愈傷組織轉入分化培養基M5時，用無菌透氣封口膜封口、增加培養基固化劑含量(3.5 g/L Phytagel)，以改善分化愈傷組織的培養條件。采取胚狀體培養時降低培養基中糖含量(25 g/L葡萄糖)，成苗培養基中改變固化劑和糖分含量(3.25 g/L Phytagel，20 g/L葡萄糖)等技術措施，可以降低棉花遺傳轉化過程中產生的畸形苗和玻璃化苗，使正常苗的產生率達到90%以上。將分化-見苗的組織培養時間控制在90～120 d，可使轉化再生株的不育率降低到30%以下。獲得再生植株并在嫁接前取試管苗葉片進行目標基因序列檢測，嫁接陽性再生植株，這樣可使轉化過程縮短2～3個月，轉化率提高到50%以上。

農桿菌介導的早熟棉高效轉化體系建立的關鍵是以高頻(50%以上)體細胞胚胎發生和植株再生的優良早熟棉品種受體為基礎，該研究總結并部分驗證出能夠體細胞再生的早熟棉品種，從中遴選出作為早熟棉轉基因受體的候選品種，其中新陸早33號經研究人員的驗證，可作為新疆早熟棉轉基因受體的優選品種，另外還有新陸早1號和新陸早32號；黃淮海棉區以中棉所24號、中棉所16號為早熟棉轉基因受體的優選品種；長江流域棉區以泗棉3號為早熟棉轉基因受體的優選品種。并結合吳家和等[41]的方法研究出高頻再生純合系的篩選技術，以農桿菌介導的中熟棉轉基因體系為基礎，對影響轉化體系的各因子進行優化，研究出建立農桿菌介導的早熟棉高效轉化體系的關鍵技術。以早熟棉高頻再生純合系種子為轉化受體，利用高效的(轉化率50%以上)農桿菌介導的轉化體系將不同功能的目標基因直接轉入早熟棉，將消除早熟棉雜交轉育改良時花期不遇和改良后代生育期延長的現象，培育適宜新疆棉區、黃淮海棉區麥棉夏播套種、長江流域棉區麥和油菜后直播等一熟棉區以及輕簡化種植所需的中早熟棉和早熟棉種質資源，可加快早熟棉轉基因育種和基因功能分析的進程，提高棉花的綜合利用價值。