根際促生菌S1菌株的分離鑒定及促生效果

呂朝陽，王 威，楊淼泠，施李鳴，張 維，張克誠，葛蓓孛

(中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

根際土壤是土壤中各種物質和養分從無機環境進入植物的重要媒介，它受植物根系分泌物、微生物與土壤之間的相互作用[1]，根際土壤微生物作為土壤-植被生態系統中最活躍和具有決定性影響的組分之一，不僅能夠參與并調節植物在生長發育中的各個環節[2-3]，還在土壤的能量流動、養分循環及有機物質轉化中發揮著重要作用。其中，根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在植物體內，附生于根系或根際土壤中的一類對病原菌有生防作用，能夠促進植物吸收礦物質等無機物，并產生有利于植物生長的化合物的有益菌，這類土壤益生菌通常也具有生物固氮、產生植物激素和抗生素等能力[4-6]。PGPR由于對植物病害具有顯著防效，并能夠促進作物的生長發育及增加產量而受到研究者的關注，成為根際微生物研究的熱點。引入外來微生物定植到根際能夠直接影響根際微生物的數量和結構，或者通過調控植物的代謝和根分泌物組分而間接影響植物根際微生物結構，進而影響植物的生長發育、抵抗病原微生物的能力等[7-10]。

互花米草(Spartinaalterniflora)，禾本科米草屬多年生植物，其莖稈粗壯且根部發達，能夠深扎于土壤中以促進泥沙的快速沉降和淤積，因此被許多國家地區引進[11]。但互花米草的過度擴散對生態系統造成嚴重影響，已成為生物入侵研究的焦點之一[12]。研究發現，互花米草能夠改變土壤微生物群落，提高根際微生物的豐富度[13-15]。因此，在互花米草根際土壤中更有可能篩選出更多種類的根際促生菌，為研發新型綠色微生物肥料和生長調節劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1土壤樣品。試驗土樣采集于廣西北海互花米草根際土壤，撥去表層約5 cm厚的土壤，用小鏟采集根際土壤并將其裝入無菌采樣袋中，標注好采樣時間和地點，帶回實驗室置于冰箱中-4 ℃保存備用。

1.1.2番茄品種。試驗所用番茄品種為改良毛粉802，購自山東安信種苗股份有限公司。

1.1.3培養基。生長素產出菌篩選培養基：R2A(M1)；菌株溶磷能力篩選培養基：蒙金娜無機磷培養基(M2)；微生物分離培養基：LB固體培養基(M3)；菌株產IAA能力篩選培養基：Salksowski 比色液(M4)。培養基的配制成分與含量見表1[14]。

表1 培養基及其組分

1.2 試驗方法

1.2.1根際微生物的分離與篩選。

1.2.1.1菌株的富集和分離。取2 g土壤樣品加入18 mL無菌水，在搖床上振蕩培養1 h后靜置10 min，使形成的土壤懸浮液分層。取2 mL上清液于LB液體培養基中，在搖床上振蕩24 h進行富集培養。取1 mL富集后的菌株懸浮液，用無菌水將懸浮液濃度調節至1×10-2CFU/mL，之后采用梯度稀釋法將濃度稀釋至1×10-7CFU/mL，分別吸取各梯度土壤懸浮液 200 μL，依次滴加至ACC篩選平板上，用無菌涂布棒均勻涂布至干燥，每個處理設置3個重復。將完成涂布分離的平板倒置培養在34 ℃的培養箱中2～3 d。

1.2.1.2菌株的篩選。觀察菌落生長情況，依據菌落的生物特征、氣生菌絲等特點篩去重復菌株。將篩選的單菌落挑取至含色氨酸的R2A液體培養基中，置于30 ℃ 200 r/min搖床上振蕩培養24 h。

(1)細菌溶磷能力的篩選。振蕩培養后分別吸取1 μL孢子懸浮液，點接在蒙金娜無機磷平板中央，于34 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h。觀察菌落周圍是否出現溶磷圈，溶磷圈越大，則該菌株溶磷效果越強。

(2)細菌產IAA(吲哚乙酸)能力的篩選。將待測菌株在含有色氨酸的液體LB培養基中培養7 d后，取上清液離心10 min，將離心后的上清液與Salksowski比色液在96孔板上1∶1混合進行顯色反應，將96孔板置于38 ℃條件下避光保溫40 min，觀察顏色變化，顏色越深說明該菌株產IAA的能力越強。

將篩選出的既有產IAA能力又有溶磷效果的菌株，采用平板劃線法進行純化，并保存在甘油中，放置在-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2菌株生理生化鑒定。采用平板劃線法將菌株S1在LB培養基上培養出單菌落，觀察菌落顏色、形態及菌體的形態，并采用細菌微量生化鑒定管對菌株S1進行生理生化鑒定試驗。

1.2.3菌株分子水平鑒定。

1.2.3.1總DNA提取及PCR擴增。使用細菌全基因組DNA提取試劑盒及細菌通用引物提取S1菌株的總DNA。

1.2.3.2PCR產物檢測、純化與測序。用移液槍取5 μL擴增后的PCR產物與1 μL 6×Loading buffer混勻，加樣于凝膠樣孔中進行電泳。約30 min后，將電泳好的凝膠取出放置在紫外透射儀下進行檢測，在約1 300 bp處看到1條亮帶，說明擴增成功。將擴增后的序列送至擎科科技有限公司測序。

將測序得到的結果輸入NCBI數據庫進行BLAST比對，選取相似度最高的一些種屬并下載其16S rRNA基因序列，利用這些序列在MEGA 7.0軟件中構建系統發育樹。

1.2.4菌株發酵液的制備及計數。將菌株接種在LB固體培養基上，在28 ℃恒溫培養箱中倒置培養，培養1 d后，接種于LB液體培養基中，28 ℃ 220 r/min 振蕩培養1 d，然后在離心機中28 ℃ 6 000 r/min離心6 min，得到的上清液即為細菌發酵液。

用梯度稀釋法將細菌發酵液濃度依次調節至1×10-9CFU/mL，每個濃度吸取100 μL細菌發酵液，依次滴加在LB固體培養皿上均勻涂布，用無菌涂布棒均勻涂布至干燥，每處理設置3個重復。將完成涂布分離的平板倒置在28 ℃ 培養箱中培養1 d，找出在培養皿上長出10～100菌落數的處理，計數并求平均值。

1.2.5菌株對番茄種子萌發的影響。用無菌水將番茄種子洗凈并浸泡4 h，控干水分后，用0.4%高錳酸鉀浸泡10 min，之后用無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸干種子表面水分。取5個50 mL無菌離心管，每個離心管放入50粒處理后的番茄種子，將已過濾的濃度為1×107CFU/mL菌株發酵液按10、100、500、1 000、2 000倍稀釋后分別得到濃度為1×106、1×105、2×104、1×104、5×103CFU/mL的發酵液，以添加相同體積、稀釋倍數相同的LB液體培養基和無菌水浸泡作為對照組，每處理重復3次。將各處理放置在25 ℃、相對濕度為90%的光照培養箱中，設置光照為12 h/d。為確保種子濕潤，每天定期噴少量無菌水。以發芽試驗當天記作0 d，8 d后統計發芽勢，10 d后計算發芽率，利用公式計算發芽指數和活力指數[16]。

發芽率=前10 d發芽的種子數/供試種子總數×100%

發芽勢=前8 d發芽的種子數/供試種子總數×100%

式中，Gt為發芽試驗終期每日發芽數；Dt為發芽日數。

活力指數V=GP×GI

式中，GP為幼苗的生長勢，該試驗以幼苗平均根質量計。

1.2.6菌株對盆栽番茄幼苗生長的影響。將番茄種子催芽后播種于裝有營養基質的盆中，每盆1株，待番茄苗長出2片真葉時，將發酵好的濃度為1×104、2×104CFU/mL的菌液和濃度為1×104、2×104CFU/mL的LB液體培養基每株 10 mL 緩慢灌入番茄苗根部；將10 mL清水注入番茄苗根部土壤中作為空白對照，每處理20株苗，每處理設置3個平行試驗，處理完畢后放置在30 ℃溫室中培養。每隔7 d各處理再分別進行一次灌根處理，累計灌根5次后取樣，小心清洗根部土壤，統計株高、根長和鮮重。測量完畢后將番茄幼苗置于60 ℃烘箱中，烘干水分后測量干重。

1.3 數據處理采用 MEGA 7.0軟件和鄰接法(Neighboring-Joinning，NJ)構建系統發育樹；采用SPSS 24.0(IBM，Armok，NY，USA)統計軟件對番茄農藝指標進行單因素方差分析和LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 互花米草根際土壤細菌菌株分離結果通過前期初篩并純化獲得了10株細菌菌株(表2)。測量各細菌菌株在蒙金娜無機磷固體培養基中溶磷圈直徑，發現Gx-Ⅰ7菌株的溶磷圈直徑最大，為3.35 cm，其次為Gx-Ⅰ1，為3.24 cm。利用IAA標準曲線基于各菌株發生顯色反應后的OD530值計算得到IAA濃度，結果表明，菌株-Gx-Ⅰ1和Gx-Ⅰ5 IAA濃度相對較高，IAA濃度分別為7.20和6.81 μg/mL。綜合溶磷及分泌IAA能力2個指標，選取溶磷及產IAA能力均較強的菌株Gx-Ⅰ1進行深入研究，并將其命名為菌株S1。

表2 互花米草根際土壤細菌溶磷及產IAA能力篩選

2.2 菌株S1的鑒定

2.2.1形態及生理生化特征。菌株S1在LB培養基上的菌落呈乳白色，圓形，表面光滑、濕潤，革蘭氏染色結果為陰性，菌體形態為桿狀。細菌微量生化鑒定檢測結果表明(表3)，菌株S1對尿素、枸櫞酸鹽、動力、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、葡萄酸鹽、產氣試驗呈陽性，對甲基紅、靛基質、硫化氫、苯丙氨酸、側金盞花醇 、賴氨酸、木糖、革蘭氏染色均為陰性。

表3 互花米草根際土壤分離的細菌菌株S1的生理生化特征

2.2.2分子生物學鑒定。將細菌S1的16S rRNA片段擴增后長度約1 300 bp(圖1)。擴增后的片段測序后將序列提交至NCBI數據庫進行BLAST檢索和比較，得到相近種屬的16S rRNA序列，利用這些序列構建系統發育樹(圖2)。結果表明，該分離菌株與陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)同屬于一個分支，親緣關系較近，同源性達到99%，結合生理生化鑒定將該菌株暫定為陰溝腸桿菌。

注：M.DL 5000 DNA梯帶；1～2.細菌擴增片段；目的條帶約1 300 bp

圖2 菌株S1及相關細菌16S rRNA序列的系統發育樹

2.3 菌株S1對室內番茄種子萌發的影響番茄種子萌發的測定結果見表4。表4表明，菌株發酵液浸泡處理組中，1×104CFU/mL的發酵液能夠顯著促進種子萌發，發芽率為72.20%，發芽勢為72.22%，發芽指數為26.23，活力指數為95.48，相比于CK分別提高了88.36%、106.34%、159.19%、113.46%。發酵培養基浸泡處理組中，2×104、5×103CFU/mL的發酵培養基對種子萌發有促進作用，其中5×103CFU/mL發酵培養基效果最好，相比于CK組發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別提高了41.93%、52.37%、69.47%、6.44%。以上分析表明，發酵培養基和菌株發酵液在一定濃度下均能促進種子萌發，其中1×104CFU/mL菌株發酵液促進種子萌發的效果最佳。

表4 S1菌株發酵液對番茄種子萌發的影響

2.4 菌株S1對盆栽番茄幼苗生長的影響發酵液對室內番茄幼苗生長的影響見圖3。番茄各生長指標的測量結果(表5)表明，經菌株發酵液和發酵培養基處理過的菌株，其根長、株高、鮮質量、干質量均高于CK。說明2種處理均可以促進番茄幼苗的生長，試驗數據顯示，S1菌株發酵液濃度為1×104CFU/mL時，對番茄的促生作用最為顯著，與CK相比，根長、株高、鮮質量和干質量分別增加了63.79%、74.66%、155.17%和150.00%。

表5 菌株發酵液對番茄生長的影響

3 討論

PGPR可通過多種作用機制促進作物的生長發育并提高產量，如改善植物根際的營養環境，增強植物的固氮能力；通過分泌各種植物激素、維生素或氨基酸等促進植物生長；產生抗生素和胞外溶解酶等抑制病原菌的生長，減輕對植物的危害[17-19]。利用PGPR制成微生物肥料可緩解因化肥的過度使用而造成的環境污染問題[20]，特別是近年來農業部提出化肥零增長的要求，使得農業上對綠色高效的微生物肥料的需求更為迫切。因此，利用PGPR研發出新型環保的微生物肥料和植物生長調節劑對農業的發展具有重要意義。該研究從廣西北海互花米草根際土壤中分離獲得1株具有溶磷及分泌IAA能力的菌株陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，其發酵液在1×104CFU/mL時能夠顯著促進番茄種子萌發和幼苗生長。研究表明，IAA可調控植物的生長發育過程，特別是對植物次生根的發育具有明顯促進作用。因此，若接種的根際促生菌能夠產生大量IAA，則能誘導植物產生大量的次生根，從而建立起植物幼苗根系的穩定發育系統，使幼苗能夠健康快速生長[21-22]。具有溶磷功能的細菌可分泌有機酸與部分金屬離子鰲合，將土壤中難溶性磷轉化為可溶性磷，供植物吸收，促進植物生長[23]。該研究發現的植物促生菌為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，隸屬腸桿菌屬，目前已報道的植物根際促生菌大多屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Psewdomonas)，此外，還包括黃桿菌屬(Xanthomornas)、節桿菌屬(Arthrobacter)、伯克霍氏菌屬(Burkholderia)、弗蘭克氏菌屬(Frankia)、固氮菌屬(Rhizobium)等[24]，現階段國內外鮮見將陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)作為植物根際促生菌的相關報道。綜上所述，該研究發現的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)具有良好的生防應用前景，可豐富植物促生菌的種類，以期為開發研制新的微生物源植物生長劑及微生物肥料提供原材料。

4 結論

通過平板初篩、盆栽試驗及16S rRNA分子鑒定技術篩選出1株根際優良促生菌株陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，兼具溶磷、分泌生長素性能，該菌株對番茄種子的萌發及幼苗的生長有顯著的促進作用。