豬瘟病毒實時熒光重組酶聚合酶擴增檢測方法的建立及應用

楊 俊，聶福平，王 昱，史梅梅，謝曉倩，王國民，李賢良，吳 蕊，張 歡，唐昌杰，李應國

(重慶海關技術中心，重慶 400020)

豬瘟，又被稱為古典豬瘟(classical swine fever,CSF)、爛腸瘟，是一種感染了豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)而引起的高度接觸性的急性傳染病。該病流行廣泛，發病率和死亡率高，是世界動物衛生組織(OIE)規定的通報類傳染病[1]，在我國《進境動物檢疫疫病名錄》中列為一類傳染病。

重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種新型的等溫核酸擴增技術，在較低溫度下，15～30 min即可完成檢測，具有反應條件溫和、擴增效率高的優點，并且通過在反應體系中加入熒光探針可實現對擴增對象的實時檢測。該研究基于RPA檢測技術，針對CSFV基因組的5′端非編碼區高度保守序列設計并合成了特異性的引物和exo探針，成功建立了實時熒光重組酶聚合酶擴增檢測豬瘟病毒的方法，以期為豬瘟快速診斷提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1毒株。豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)疫苗株(石門株)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis，TGEV)(IND型)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)(AP76)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)(SH0165)、豬肺炎支原體(mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)(168-L)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)(BIAH-001)、豬圓環病毒2型(porcine cirovirus Type 2，PCV-2)(PM167)、豬水皰病病毒(swine vesieular virus，SVDV)、豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)疫苗株(cp99)，由重慶海關技術中心動物檢疫實驗室保存。

1.1.2主要試劑。TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit、Premix TaqTM、DL2000 DNA Marker、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit、PMDTM19-T Vector Cloning kit、DH5a感受態細胞、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification kit,購自寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；Twist Amp exo kit,購自英國Twist Dx 公司。

1.1.3主要儀器。Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測系統(英國OptiGene)；NanoDrop oneC 微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo Scientific);Veriti 96多功能梯度PCR儀器(美國Applied Biosystems);GelDoc XR+凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad);Centrifuge 5417R高速離心機(德國Eppendorf)。

1.2 試驗方法

1.2.1引物和探針。CSFV 5′NTR由360～374個堿基組成，具有高度保守性。該研究選擇該部分序列作為擴增對象，從NCBI下載CSFV基因組5′NTR序列進行分析，參考Twist Amp exo kit關于RPA引物和exo探針的設計要求，利用Primer premier 5軟件設計RPA引物和exo探針，委托TAKARA公司合成。引物及探針序列如下：CSFV-RPA-F：5′-GCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGAC-3′；CSFV-RPA-R：5′-CTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGA-3′；CSFV-RPA-P：5′-GTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGTTCTAAGT(FAM)-(THF)CT(BHQ1)-GAGTACAGGACAG-(P)-3′；其中，FAM為羧基熒光素，THF為四氫呋喃，BHQ1為黑洞猝滅劑 1，P為磷酸鹽基團。

1.2.2病毒核酸的提取。使用TaKaRa公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒分別提取CSFV、TGEV、PRRSV、SVDV的RNA以及PCR-2和PPV的DNA，使用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取APP、HPS和Mhp的DNA，以上操作過程均在生物安全柜中進行。RNA提取完成后立即使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis kit反轉錄合成第一鏈cDNA。cDNA和DNA均置-20 ℃冷凍保存備用。

1.2.3質粒標準品的構建。CSFV核酸RNA提取后立即進行反轉錄合成cDNA，以該cDNA作為模板，用設計的CSFV RPA引物(CSFV-RPA-F/CSFV-RPA-R)進行PCR反應。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定得到預期大小的擴增子并回收，連接到PMDTM-19T載體，轉化到DH5α感受態細胞，從陽性克隆中提取質粒，利用紫外可見核酸蛋白分析儀(NanoDrop oneC) 測定其濃度，根據公式：拷貝數=[濃度(ng/μL)×6.02×1023×10-9]/(DNA長度×660)計算質粒拷貝數，-20 ℃保存備用。

1.2.4CSFV實時熒光RPA反應條件的優化。Twist Amp exo kit提供的反應管中已經預混了各種酶，按其說明書要求，向反應管中加入Rehy-dration Buffer 29.5 μL、ddH2O 8.2 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL，10 μmol/L探針0.6 μL，模板5 μL，向反應管的蓋子中加入Mg2+2.5 μL，蓋上蓋，瞬時離心后立即將反應管置于OptiGene Genie Ⅱ等溫擴增熒光檢測系統，分別在35、37、39、40、42 ℃下反應40 min，根據擴增曲線，確定最適反應溫度和最佳反應時間。

1.2.5CSFV實時熒光RPA特異性試驗。RPA引物長度為30～35 nt，exo探針長度為46～52 nt，比普通PCR和熒光定量PCR的引物、探針都更長，理論上具有更高的特異性。為了驗證CSFV實時熒光RPA的特異性，選擇CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、PCV-2、SVDV、PPV的cDNA或DNA作為模板，以無菌去離子水作為陰性對照，在確定的最佳反應條件下進行檢測，評價方法的特異性。

1.2.6CSFV實時熒光RPA敏感性試驗。為測試CSFV實時熒光RPA檢測方法的敏感性，將擴增片段轉化入DH5α感受態細胞中，提取質粒并測定濃度，計算拷貝數作為標準品。將質粒標準品進行10倍連續稀釋，取各個稀釋度的質粒分別作為模板，在最佳反應條件下進行RPA擴增，確定該方法的最低檢出限。

1.2.7臨床樣品檢測。從重慶某養豬場采集20份血清樣本、5份淋巴結樣本、5份肝臟樣本和3份腎臟樣本，分別提取核酸，用建立的CSFV實時熒光RPA方法進行豬瘟病毒核酸檢測，以評價其在實際檢測中的效果，同時，采用國家標準GB/T 16551—2020對所有樣本進行豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測，比較2種方法的符合性。

2 結果與分析

2.1 標準品的制備將CSFV擴增片段轉化入DH5α感受態細胞中，提取含有CSFV核酸片段的重組質粒進行測序，將測序結果提交NCBI進行BLAST比對，結果顯示，插入的核酸片段大小為124 bp，與預期一致，與CSFV具有高度同源性，相似度達到99%以上。經紫外可見核酸蛋白分析儀測定，該質粒濃度為25.5 ng/μL，A260/A280值為1.87，計算出拷貝數為8.3×109copies/μL。

2.2 CSFV實時熒光RPA反應條件的優化將配制好的反應體系分別在35、37、39、40、42 ℃下進行RPA反應，檢測熒光強度。試驗結果顯示(圖1)，隨著反應溫度升高，檢測到熒光信號所需的時間更短，且最終的熒光強度也更高，但當反應溫度超過39 ℃后，熒光信號反而出現下降；隨著時間延伸，熒光信號不斷積累，但30 min以后，熒光強度不再升高，說明反應進入平臺期。綜上，CSFV實時熒光RPA最佳反應溫度和反應時間分別為39 ℃、30 min。

圖1 豬瘟病毒實時熒光RPA檢測方法的優化

2.3 CSFV實時熒光RPA特異性試驗為了驗證CSFV實時熒光RPA檢測方法的特異性，選擇CSFV、TGEV、APP、HPS、Mhp、PRRSV、SVDV、PPV、PCV-2等豬場常見的豬病作為研究對象，提取核酸后分別用建立的實時熒光RPA方法進行擴增，結果見圖2。隨著反應時間的進行，CSFV陽性樣品在反應開始6 min后熒光強度逐漸升高，相比之下，其他樣本和陰性對照在30 min之內都無熒光信號產生，說明該方法對上述除CSFV之外的常見豬病病原無反應，特異性良好。

注：1.豬瘟病毒;2～10.豬傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型、豬水皰病病毒、豬細小病毒、陰性對照

2.4 CSFV實時熒光RPA敏感性試驗經測定CSFV重組質粒濃度為8.3×109copies/μL，將該質粒進行連續10倍稀釋，取每個稀釋度的質粒5 μL分別作為模板，用建立的實時熒光RPA方法進行檢測，結果顯示(圖3)，隨著質粒濃度的降低，能夠檢測到熒光信號的時間也隨之延后，而且最終的熒光信號強度也相應降低，當CSFV重組質粒濃度降至8.3×102copies/μL 以下，檢測不到熒光信號，因此，該CSFV實時熒光RPA方法最低檢出限為8.3×102copies/μL，靈敏度較好。

注:1～6為8.3×107～8.3×102 copies/μL

2.5 臨床樣品檢測從重慶某養豬場采集了33份樣本，同時使用建立的CSFV實時熒光RPA方法和國家標準方法對這些樣本進行豬瘟病毒核酸檢測，結果顯示(表2)，RPA方法從20份血清樣本中檢出2份CSFV核酸陽性，從5份淋巴結樣本中檢出2份CSFV核酸陽性，從5份肝臟樣本中檢出1份CSFV核酸陽性，從3份腎臟樣本中檢出1份CSFV核酸陽性，與國家標準的實時熒光RT-PCR檢測結果完全一致。

表2 豬瘟病毒臨床樣本檢測結果

3 討論與結論

我國于1954年研制出豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)，并大規模地進行疫苗接種，現成功控制了該病的大流行，但目前豬瘟仍呈散發流行的新態勢，增大了豬瘟防控的難度。此外，家豬和野豬都是CSFV的宿主，野豬可能在CSF的流行和傳播中發揮重要作用。即便某地區的家豬中已經根除了CSF，如果同地區的野豬群中仍有該病流行，仍有可能將病毒傳入養殖場中[2]。

快速可靠的診斷對于及時實施CSFV控制措施至關重要，由于目前豬瘟常以非典型形式出現，且癥狀與豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病、豬細小病毒等相似，因此，需要進行實驗室檢測來確診該病。CSFV的實驗室檢測方法主要有RT-PCR試驗[3-11]，該技術目前已比較成熟，有許多商品化的CSFV核酸檢測試劑盒可供選擇。為了實現CSF的現場檢測，有研究人員開發出了便攜RT-PCR系統[12]、引物-探針能量轉移 RT-qPCR系統[13-14]等。為了替代PCR的熱循環模式還誕生了很多等溫擴增方法，如恒溫隔絕式RT-qPCR[15]、環介導等溫擴增 (LAMP)[16-21]和RPA；CSFV也可以通過傳代細胞系，如豬腎細胞系PK15或SK6上培養分離而得到確診，但病毒分離對環境潔凈度要求極高，需要非常熟練的試驗人員來操作，容易發生污染導致試驗失敗；此外，還可以使用血清學的方法來診斷CSFV，如熒光抗體或免疫過氧化物酶測定法等[22-23]，但有研究指出，同屬的牛病毒性腹瀉病毒-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea-mucosal dicease virus,BVDB)和綿羊邊界病病毒(border disease virus,BVD)在抗原性上與CSFV存在交叉反應，這2種病毒都能夠感染豬，而且抗體水平通常比CSF高[24]。因此，血清學的方法在檢測豬瘟病毒方面存在敏感性低、特異性差的問題，僅適用于發病豬的檢測[25]。

RPA最早由Niall Armes于2006年提出，該技術包含3種核心蛋白、重組酶(T4 UvsX protein)、重組酶加載因子(T4 UvsY)和單鏈結合蛋白(T4 gp32)。重組酶在重組酶加載因子的協助下，尋找并侵入同源序列形成D-環結構，啟動鏈置換反應，DNA聚合酶(Bsu或Sau)則在引物的3-OH端開始合成一條與父鏈完全一樣的子鏈，最后，實現類似PCR結果的目標DNA指數擴增。相比PCR技術，RPA的技術優勢主要體現在：①反應效率高，節省時間。RPA反應在恒溫條件下進行，明顯減少循環加溫和降溫的等待時間；反應具有高度的并行性，一條鏈上可以同時進行多個聚合酶的擴增。②對儀器設備的要求低，適合田間、基層實驗室等開展核酸檢測和研究。相比其他等溫擴增技術，如基于核酸序列的擴增(NASBA)、信號介導的核酸擴增技術(SMART)、依賴解旋酶核酸擴增(HDA)、環介導等溫擴增(LAMP)等，RPA同樣優勢明顯，具體表現在：①對核酸類型無要求，可以實現對DNA或RNA信號的放大，而NASBA只能擴增RNA。②容易掌握，僅需設計一對稍長的特異引物(30～35 mer)即可進行RPA試驗，也可以再設計一條帶熒光標記的探針實現實時熒光檢測；而LAMP 技術需要多對引物，設計難度高，要篩選出合適的引物需要耗費大量工作。③RPA的產物是雙鏈DNA分子，可以利用許多PCR平臺成熟的試劑和技術進行分析；LAMP的擴增產物是一些大小不等的片段,對下游技術限制較大，無法進行直接克隆和測序，只能用于判斷目的基因的存在，這也是LAMP方法最大的局限性。正因為RPA的上述優點，該技術自問世以來深受廣大科研工作者喜愛，被稱為有望替代PCR的新一代型核酸檢測技術，在疫病診斷方面得到廣泛應用。楊俊等[26]建立了綿羊痘病毒和山羊痘病毒實時熒光重組酶聚合酶擴增檢測方法，靈敏度高，特異性強，為綿羊痘病毒和山羊痘病毒的鑒別診斷提供了技術支持；Abd等[27]基于RPA技術，建立了可以檢測所有的7個口蹄疫病毒血清型的方法；Wang等[28]建立了PCV2實時熒光RPA檢測方法，靈敏度比普通PCR高10倍；王建昌等[29]針對非洲豬瘟病毒VP72保守基因序列建立的RPA檢測方法，在38 ℃恒溫反應30 min即可獲得檢測結果。

該研究在開展過程中也發現RPA存在的不足，如擴增片段不能太長，超過500 bp則會明顯降低其擴增效率，甚至無法擴增出目的片段；其次，由于其所需反應溫度溫和、反應速率快，往往在加樣過程中擴增就已經開始，無法控制擴增起始時間，暫時無法實現熒光PCR的定量檢測功能，但對于定性檢測無任何影響。

該研究基于RPA檢測技術，針對CSFV 5′UTR高度保守的序列，設計了特異性引物和探針，建立了實時熒光RPA檢測方法，實現了CSFV的快速診斷。該方法與APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV、SVDV、TGEV、PPV無交叉反應，檢出限達到8.3×102copies/μL，特異性好，敏感性高，為CSFV的快速、準確診斷提供了強有力的工具。