茶葉中摻雜大米成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

黃迎波，黃才新，江 杰，袁小雅，朱金國(guó)

(長(zhǎng)沙海關(guān)，湖南長(zhǎng)沙 410004)

近年來隨著茶葉需求量不斷增長(zhǎng)，茶葉消費(fèi)市場(chǎng)以次充好、假冒偽劣甚至摻雜摻假時(shí)有發(fā)生，給正常的茶葉消費(fèi)和進(jìn)出口貿(mào)易造成不良影響[1-2]。其中茶葉中摻假問題越來越嚴(yán)重，一些不法商販為獲得高利潤(rùn)在茶葉中摻雜各種谷類物質(zhì)，于茶葉初制或加工過程中加入，其目的是將茶葉重新造型，促成條狀；或使粗老茶、回籠茶扭成條，增進(jìn)重實(shí)感；或是利用谷物淀粉糊的黏性，摻入一些沙土、木灰、煤屑等；或上述摻偽兼而有之[3-4]。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)逐漸滲透到各個(gè)生物領(lǐng)域，特別是PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品、飼料中外源成分的鑒定[2-12]。目前，鮮見應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)茶葉中摻雜大米成分的報(bào)道。該研究根據(jù)大米內(nèi)源PLD基因建立茶葉中摻雜大米的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以期能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出茶葉中摻雜的大米成分。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。36份茶葉抽取自茶葉生產(chǎn)企業(yè)，從市場(chǎng)采購(gòu)的大米作為陽(yáng)性對(duì)照、金銀花作為陰性對(duì)照。

1.1.2試劑。PCR試劑購(gòu)置Promega公司，植物DNA提取試劑盒購(gòu)置天根公司。大米PLD內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR引物探針見表1。

1.1.3儀器。LightCycler 480Ⅱ(96)熒光定量PCR儀，NANOVUE微量分光光度計(jì)，Retsch GM 200粉碎破碎機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理。

(1)手工研磨法。隨機(jī)選取4份茶葉(編號(hào)分別為073、513、514、519)和含10%大米成分的茶葉，分別稱取約1 g于研缽中，加入液氮迅速研磨成茶粉。

(2)機(jī)器打碎法。隨機(jī)選取4份茶葉(編號(hào)分別為073、513、514、519)和含10%大米成分的茶葉，分別稱取約100 g，用Retsch GM 200粉碎破碎機(jī)進(jìn)行打碎，直至茶葉打成粉末狀。

1.2.2基因組DNA的提取。采用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取茶葉、大米和金銀花中的DNA；同時(shí)將不同質(zhì)量的大米磨成粉末狀摻入到茶葉中，設(shè)置4個(gè)梯度，分別為10.0%、3.0%、1.0%和0.1%，采用機(jī)器打碎法粉碎樣品，再用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA；提取的DNA在NANOVUE微量分光光度計(jì)上測(cè)定基因組DNA的濃度。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。20 μL反應(yīng)體系：Promega GoTaqqPCR Master Mix(2×)10 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、10 μmol/L的熒光探針1 μL、Rnase-free water 2 μL，最后加入DNA模板5 μL。各樣品設(shè)一個(gè)平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。使用Lightcycler 480 Ⅱ 熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增并觀察記錄結(jié)果。

1.2.4方法的特異性和靈敏度。選取未含大米成分的茶葉樣品、金銀花和含10%大米成分的茶葉樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，用大米DNA作陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)引物探針特異性。用含10.0%、3.0%、1.0%和0.1%大米成分的茶葉樣品進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

1.2.5模擬生產(chǎn)污染因素。根據(jù)茶葉生產(chǎn)過程中可能存在污染的情況，對(duì)可能涉及污染的環(huán)節(jié)進(jìn)行模擬試驗(yàn)。用粉碎過大米的破碎機(jī)杯體不經(jīng)洗滌直接粉碎未摻大米成分的茶葉樣品，用粉碎過摻雜大米成分茶葉的破碎機(jī)配套杯體不經(jīng)洗滌直接粉碎未摻大米成分的茶葉樣品，再將這2個(gè)樣品與陰性茶葉樣品、摻雜0.1%大米的茶葉樣品、大米樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.6茶葉抽檢。從30家茶葉企業(yè)抽取36批次產(chǎn)品，包括綠茶、紅茶、黑茶、白茶、眉茶、茯磚等種類，開展茶葉摻雜使假專項(xiàng)檢測(cè)；基于該研究所建立的大米內(nèi)源PLD基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)茶葉進(jìn)行摻雜大米成分檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同前處理方法提取DNA的濃度茶葉中摻雜大米成分的量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判定有直接影響，所以前處理樣品的取樣量十分關(guān)鍵。該研究采用2種常用方法對(duì)隨機(jī)選取的4份茶葉(編號(hào)分別為073、513、514、519)和含10%大米成分的茶葉進(jìn)行前處理和DNA濃度比較分析，手工研磨法取樣量少，提取的DNA濃度較低；機(jī)器打碎法取樣量大，提取的DNA濃度較高，具體結(jié)果見表2。

表2 機(jī)器打碎和手工研磨方法提取茶葉樣本基因組DNA的濃度

2.2 PLD基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增的特異性和靈敏度用2種前處理方法(手工研磨法、機(jī)器打碎法)粉碎含10%大米成分的茶葉樣品都有明顯的擴(kuò)增曲線，破碎機(jī)打碎法的擴(kuò)增曲線更顯著(圖1)。用未含大米成分的茶葉樣品、金銀花和含10%大米成分的茶葉樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，可見引物和探針僅對(duì)大米陽(yáng)性對(duì)照和含10%大米成分的茶葉擴(kuò)增陽(yáng)性，有明顯的“S”型擴(kuò)增曲線，對(duì)未含大米成分的茶葉和金銀花擴(kuò)增陰性，表明該引物和探針特異好。

圖1 2種方法前處理含10%大米茶葉樣品基因組DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物探針特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

將含10.0%、3.0%、1.0%和0.1%大米成分的茶葉樣品提取DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線見圖3。從圖3可以看出，含10.0%、3.0%、1.0%和0.1%大米的茶葉基因組DNA都有顯著的“S”型擴(kuò)增曲線，因此實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度能達(dá)到0.1%。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

2.3 生產(chǎn)污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響模擬生產(chǎn)污染的2個(gè)樣品與摻雜0.1%大米的茶葉樣品同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，用粉碎過摻雜大米成分茶葉的破碎機(jī)配套杯體不經(jīng)洗滌直接粉碎的陰性茶葉樣品無擴(kuò)增曲線，用粉碎過大米的破碎機(jī)杯體不經(jīng)洗滌直接粉碎的陰性茶葉樣品在35個(gè)循環(huán)以后有擴(kuò)增，而摻雜0.1%大米的茶葉樣品在32個(gè)循環(huán)左右出現(xiàn)擴(kuò)增，表明生產(chǎn)污染對(duì)使用該方法檢測(cè)茶葉摻雜大米成分試驗(yàn)結(jié)果基本無影響。

圖4 生產(chǎn)污染模擬試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線

2.4 茶葉抽檢結(jié)果對(duì)30家茶葉企業(yè)抽檢的36批茶葉樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其中6批樣品檢出大米PLD基因且均為綠茶，檢出率為17%(表3)；Ct值均在31以下，分別來自5家企業(yè)。

表3 茶葉抽檢結(jié)果匯總

3 小結(jié)與討論

該研究建立了基于PLD基因檢測(cè)茶葉中是否摻雜大米成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，研究了方法的特異性和靈敏度，模擬生產(chǎn)污染環(huán)節(jié)排除假陽(yáng)性可能。使用該方法時(shí)，僅直接觀察實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖，2 h就可以準(zhǔn)確檢測(cè)某茶葉樣品是否摻雜大米成分，靈敏度能達(dá)到0.1%。該方法具有較高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，操作簡(jiǎn)便，不容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，可作為茶葉樣品中摻雜大米成分的快速檢測(cè)方法，在茶葉摻雜谷物類物質(zhì)檢測(cè)把關(guān)上具有較好的應(yīng)用前景。

利用所建立的方法對(duì)36份茶葉樣品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5家企業(yè)的6批次茶葉產(chǎn)品都不同程度檢出含有大米成分，檢出率為17%。經(jīng)對(duì)檢出原因進(jìn)行調(diào)查分析，6批次產(chǎn)品中，有1批次茶葉由于生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)銷售完畢，無法實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步追溯調(diào)查，有4批次茶葉原料使用了珠茶原料或珠茶副產(chǎn)品，不屬于違規(guī)行為(食品安全標(biāo)準(zhǔn)中明確珠茶在整型過程中可依據(jù)傳統(tǒng)工藝添加糯米糊)；有1批次茶葉是由于原料供應(yīng)商為了塑形在加工過程中違規(guī)添加糯米糊。向綠茶(眉茶)里混入加工過的大米成分的違規(guī)行為，在今后的茶葉摻雜使假專項(xiàng)檢測(cè)活動(dòng)中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。