煙梗中木質素的分子量分析

孫瑞琪，任夢夢，熊駿威，王 軍*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083;2.上海煙草集團有限公司技術中心，上海 201315)

煙草是一年生草本植物，屬茄科(Solanaceas)煙草屬(Nicotiana)。煙梗即煙草葉片的粗硬葉脈，占整個煙葉重量的25%左右[1]，作為煙葉的一部分，主要起支撐葉片的作用。煙梗中木質素的平均含量約為8%，其分子聚合度較大，燃燒熱裂解性能較差[2]，熱裂解后會產生苯酚、鄰苯二酚、烷基兒茶酚等物質，這些酚類化合物不僅會引起澀口，而且對健康有害[3]。煙梗中木質素的聚合度及分子量是影響木質素高溫條件下裂解的重要因素[4]，會影響燃吸品質，因此，除了研究木質素的含量，還需要分析木質素分子量的大小，才能夠有效地評價煙梗的品質。

目前用來測定分子量分布的方法主要有質譜法、凝膠滲透色譜法、光散射法、蒸汽壓滲透法、超濾法等。其中凝膠滲透色譜(GPC)法是目前分子量測定最常用的方法，其分離原理是基于分子體積大小不同而對不同分子量的樣品進行分離和測定[5-7]。但由于煙梗中木質素分子的溶解度較差，影響分子量的準確測定。目前常用四氫呋喃 (THF) 作為溶劑溶解木質素，但木質素在溶解前需要進行煩瑣的提取及衍生化處理以提高溶解性。衍生化的方法有乙酰化、甲基化、硅烷化等[8]，但這些方法操作復雜，溶解性改善有限，導致測定誤差較大[9]，應用受到限制。LiCl/DMAC(氯化鋰/二甲基乙酰胺)體系中，LiCl溶解在DMAC中形成大陽離子[Li(DMAC)]+和游離的Cl-，這樣能夠有效地打開原晶區的氫鍵網絡，使氫鍵等相互作用發生斷裂,分子鏈變得較為松弛,易溶于溶劑中[10-12]，更容易與緊密排列的結晶區接觸,增加大分子的溶解度[13-15]。因此，該研究利用LiCl/DMAC溶劑體系活化木質素分子，對木質素的分子量及其分布進行研究。

1 材料與方法

1.1 試材烤煙煙梗(湖南短梗)。超純水(去離子水經過Milli-Q超純水儀制的，18.2 MΩ·cm)；二甲基乙酰胺(DMAC)、無水氯化鋰(色譜級，北京百靈威科技有限公司)；吡啶(分析純，北京百靈威科技有限公司)；α-淀粉酶、糖化酶(分析純，北京索萊寶科技有限公司)；脫堿木質素(分析純，北京百靈威科技有限公司)。

1.2 儀器Agilent 1260凝膠滲透色譜儀(配置示差折光檢測器、光散射檢測器，安捷倫科技有限公司)；GPC分離柱[重均分子量(Mw)200～3 000 000 Da，PLgel MIXED-C 5 μm，7.5 mm×300 mm，安捷倫科技有限公司];萬分之一天平(BS200S-WEI，德國Sartorius公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1煙梗樣品前處理。

1.3.1.1去除脂溶性物質。煙梗經冷凍干燥除去水分，經高速粉碎機打碎呈粉末狀，過60目篩；稱取1.0 g左右的粉狀樣品，加入25 mL乙酸乙酯超聲30 min，離心(4 000 r/min，5 min)，所得沉淀物再利用上述方法第二次超聲處理。

1.3.1.2乙醇超聲提取去除可溶性糖、色素及酚類物質等。向“1.3.1.1”沉淀中加入25 mL 的85%乙醇超聲30 min(2遍)，離心(4 000 r/min，5 min)，濾渣用冷水反復洗滌，向上清液中加入DNS試劑，沸水浴共熱5 min后，根據是否顯色判斷濾渣中可溶性糖是否去除完全。

1.3.1.3α-淀粉酶、糖化酶酶解去除淀粉大分子物質。向“1.3.1.2”濾渣中加入40 mL pH=6的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液及2 000 U/g的α-淀粉酶，60 ℃恒溫水浴水解2.5 h；之后加入40 mL pH=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液及10 000 U/g的糖化酶，60 ℃恒溫水浴水解1.5 h，離心(4 000 r/min，5 min)，濾渣用冷水反復洗滌。

1.3.1.4纖維素酶、果膠酶、蛋白酶酶解去除纖維素、果膠、蛋白質等大分子物質。向“1.3.1.3”濾渣中加入40 mL pH=4.7的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，分別加入纖維素酶、果膠酶、蛋白酶(用量分別為150、5 000、5 000 U/g)，搖勻后置于恒溫振蕩培養箱中，在45 ℃(90 r/min)條件下酶解10 h；酶解后，將酶解液離心(4 000 r/min，5 min)，濾渣用冷水反復洗滌。

1.3.2煙梗中木質素的提取。向“1.3.1.4”濾渣中加入25 mL NaOH/尿素溶液，其中NaOH的質量分數是8%，尿素的質量分數是12%；在-10 ℃下攪拌30 min，然后離心分離，得到下層濾渣。向濾渣中加入20 mL質量分數為17.5%的硫酸溶液，在100 ℃下攪拌反應30 min，離心分離，得到上層清液和下層濾渣。用純水洗滌下層濾渣至中性，再用丙酮洗滌3次，然后放在50 ℃的烘箱中干燥20 min；再加入25 mL NaOH/尿素溶液，其中NaOH的質量分數是8%，尿素的質量分數是12%；在-10 ℃下攪拌30 min，然后離心分離，將濾渣進行冷凍干燥，即得到提取的煙梗木質素。

1.3.3煙梗木質素的活化。稱取50 mg提取的木質素于玻璃瓶中，加入10 mL的DMAC溶液，在150 ℃油浴中加熱2 h活化木質素，離心后得到濾渣。

1.3.4煙梗木質素的溶解。加入適量的無水LiCl在10 mL DMAC中，使得LiCl濃度為8%(w/v)，待LiCl完全溶解后，加至活化后的木質素濾渣中，100 ℃加熱攪拌2 h，降溫至50 ℃，攪拌24 h，室溫放置一段時間后，用DMAC稀釋定容至 25 mL 容量瓶中，待用。

1.3.5煙梗木質素分子量的測定。

1.3.5.1溶液配制。

(1)樣品溶液。分別稱取25、50 mg提取的木質素，按照“1.3.3”和“1.3.4”方法將其活化、溶解，定容至25 mL容量瓶中，制得濃度為1.0、2.0 mg/mL的樣品溶液，備用。

(2)流動相。稱取一定量的無水LiCl加至DMAC溶液中配制成0.5%(w/v)LiCl/DMAC溶液，待其完全溶解后，使用溶劑過濾器過濾3次，濾膜采用0.22 μm的有機膜，每次過濾均需重新更換濾膜。

(3)標準品溶液。因聚苯乙烯(PS)含有苯環，結構與木質素更相近，所以選擇PS作為標準品。準確稱取0.020 0 g的PS標準品，加入流動相使其完全溶解，將其定容至10 mL容量瓶中，搖勻，制得2.0 mg/mL的標準品溶液。

1.3.5.2凝膠滲透色譜分析(GPC檢測)。分別將“1.3.5.1”樣品溶液及標準品溶液用0.45 μm的有機膜過濾，之后進行GPC分析。標準品聚乙烯的比折光指數增量(dn/dc)為0.152，重均分子量(Mw)為114 200 Da，相對于水的折光率為0.041。GPC檢測條件：流動相0.5%(w/v)LiCl/DMAC溶液，進樣量50 μL，樣品濃度2.0 mg/mL，激光相對能量(LS)100%，柱溫60 ℃，示差折光檢測器(RI)溫度40 ℃，流速0.8 mL/min，分析時間20 min。

2 結果與分析

2.1 煙梗木質素GPC分析條件的優化

2.1.1樣品濃度的優化。在其他條件不變的情況下(流速0.8 mL/min、柱溫60 ℃、LS 100%)，按照“1.3.5”方法，考察不同樣品濃度(1.0、2.0 mg/mL)對GPC分析的影響，結果如圖1所示。

樣品濃度對色譜峰響應值影響較大，一般樣品濃度越大，峰響應越好。由圖1可知，當樣品濃度由1.0 mg/mL增至2.0 mg/mL時，LS 90°響應值顯著增強，原因在于LS檢測器是利用物質微粒(包括分子)對光的散射作用來進行分析的，其響應值與分子量和濃度線性相關，當濃度較高時響應值較大，有助于分子量的分析；但樣品濃度過高會超過色譜柱有效分離樣品的承載能力，影響色譜柱的柱效，導致對稱的色譜峰變形。該研究中樣品濃度為2.0 mg/mL時測定效果達到了需求，綜上所述選擇樣品濃度2.0 mg/mL進行分析。

圖1 不同樣品濃度條件下LS 90°色譜圖

2.1.2流速的選擇。在其他條件不變的情況下(樣品濃度2.0 mg/mL、LS 100%、柱溫50 ℃)，考察不同流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)對GPC分析的影響，結果如圖2～3所示。

圖2 不同流速條件下LS 90°色譜圖

圖3 不同流速條件下RI色譜圖

由圖2～3可知，當流速為0.6 mL/min時，峰形較寬，保留時間較長，峰形拖尾明顯；當流速為1.0 mL/min時，峰形較窄，柱壓較高；流速為0.8 mL/min時，峰形較好，且柱壓和保留時間合適，所以確定流速為0.8 mL/min。

2.1.3柱溫的選擇。在其他條件不變的情況下(流速0.8 mL/min、樣品濃度2.0 mg/mL、LS 100%)，按照“1.3.5”方法，考察不同柱溫(50、60、70 ℃)對GPC分析的影響，結果如圖4所示。

圖4 不同柱溫條件下LS 90°色譜圖

柱溫對柱壓力及峰響應值影響較大。當溫度較低時，流動相黏度較大，柱壓力較大，不利于流動相通過色譜柱，影響分離效果；當溫度較高時，雖然流動相的黏度明顯降低，但溫度升高，目標物的折光指數顯著降低，檢測靈敏度較差，且容易造成柱流失，對色譜柱填料不利。從圖4可以看出，當柱溫為50 ℃時，溫度較低，分離效果欠佳；當柱溫為70 ℃時，響應值較低；而當柱溫為60 ℃時，峰基線平穩，峰形較好，靈敏度良好，最終選擇柱溫60 ℃為分析條件。

2.2 煙梗木質素分子量分析在優化的GPC參數條件下，利用標準品聚苯乙烯對系統進行校正，結合RI與LS 90°、LS 15°檢測器，測定煙梗木質素的分子量，標準品及樣品色譜圖分別如圖5～6所示。煙梗木質素分子量分布及各分子量計算結果如圖7所示。

圖7 煙梗木質素的分子量分布

通過圖7的數據計算，得到煙梗木質素的Mw為8 064 Da，煙梗木質素分子量集中分布在103～104Da。由圖6可知，樣品在RI中的保留時間比在LS中的保留時間更長，樣品RI與LS出峰時間并沒有像標準品那樣更相近。原因在于LS響應與濃度及分子量有關，而RI響應僅與濃度有關，當使用標準品校正時，其分子量較均勻且為定值，相當于此時LS也僅與濃度有關，因此標準品的RI及LS峰形能對應。但是樣品木質素的分子量分布較寬，有高分子量部分和低分子量部分，LS此時與濃度和分子量都相關，這就造成LS與RI中色譜峰不能完全對應。這種差異可以為分子量分布提供分析手段。

經過上述研究發現煙梗木質素活化處理后可以溶解在LiCl/DMAC溶劑體系中，且檢測器測到的色譜圖峰形較好，基線平穩，響應值較強，因此可以利用LiCl/DMAC溶劑體系測定木質素的分子量。

3 結論

從煙梗中分離提取獲得的木質素經DMAC高溫活化后，選用LiCl/DMAC體系進行溶解，煙梗木質素分子量采用GPC分析，通過優化最終確定樣品濃度為2.0 mg/mL,柱溫為60 ℃,流速為0.8 mL/min，流動相為0.5%(w∶v)LiCl/DMAC溶劑；在優化的GPC條件下，利用標準品PS對系統校正，測得的煙梗木質素的分子量為103～104Da，Mw為8 064 Da。該方法為測定煙梗中木質素分子量提供了參考。