“微生物的接種以及菌落和抗生素抑菌現(xiàn)象的觀察”實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

吳曉凌 譚桂花

（江陰市青陽中學(xué) 江蘇無錫 214401）

“微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)”這一實(shí)驗(yàn)是高中生物的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)，常見的是利用大腸桿菌進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本技術(shù)。在高三一輪復(fù)習(xí)時(shí)，筆者將該部分內(nèi)容與人教版新教材必修2中“探究抗生素對細(xì)菌的選擇作用”有機(jī)整合進(jìn)行復(fù)習(xí)，確定了本節(jié)課的課題“微生物的接種以及菌落和抗生素抑菌現(xiàn)象的觀察”，以培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維與科學(xué)研究能力，提升學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。

然而實(shí)驗(yàn)材料較難購買、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、時(shí)間跨度大、儀器設(shè)備不全等因素制約著學(xué)校全面開展微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，影響教學(xué)效果。為讓全體學(xué)生都有動手實(shí)驗(yàn)的機(jī)會，筆者從實(shí)驗(yàn)材料獲取、實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化、無菌環(huán)境簡化等方面對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一系列探索，以保證實(shí)驗(yàn)條件相對較差的學(xué)校也能因地制宜地開展微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，從而有效落實(shí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 實(shí)驗(yàn)材料的獲取

1.1 菌種采集和懸浮液制備

由于菌種購買途徑少且價(jià)格貴，土壤、池塘中有多種微生物，這些都是菌種的來源。取10 g土壤，加適量無菌水，制成土壤溶液。取池塘水和自來水各0.1 mL，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每種涂布3個(gè)培養(yǎng)基，并設(shè)置一個(gè)培養(yǎng)基空白對照。將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)含自來水的平板中只有一個(gè)平板中出現(xiàn)了一個(gè)菌落，其他2個(gè)平板中沒有菌落出現(xiàn)；含池塘水的3個(gè)平板中各出現(xiàn)了兩三個(gè)零星的菌落；而取自土壤水的3個(gè)平板中長滿了菌落，且主要是四周圓滑的白色小點(diǎn)狀和絲狀的2種菌落。

為了鑒定白色小點(diǎn)狀的微生物是否是大腸桿菌，挑取單菌落放入牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基。由于學(xué)校沒有搖床設(shè)備，只能置于37℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和淘寶上購買的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中。同樣條件下，培養(yǎng)24 h，在伊紅美蘭培養(yǎng)基中觀察到黑色、帶有金屬光澤的菌落，由此確定擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液中有大腸桿菌。普通培養(yǎng)基中觀察到大量形態(tài)大小基本相同的白色菌落，從而確定懸浮液濃度適合做抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適抗生素濃度

筆者從淘寶上購買了獸用青霉素。為讓學(xué)生觀察到大小不同的抑菌圈，教師需先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較不同濃度抗生素對特定菌種的抑菌效果，從中挑選出合理濃度用于學(xué)生實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所買的青霉素包裝上的說明書，配制了青霉素原液，并分別稀釋了10倍、20倍和40倍。用打孔器制備圓形濾紙片，分別浸泡于不同濃度的青霉素溶液中；24 h后取出，將圓形濾紙片置于烘干箱中烘干備用。

2 學(xué)生實(shí)驗(yàn)

教師需要準(zhǔn)備多次擴(kuò)大培養(yǎng)的大腸桿菌菌液和不同稀釋倍數(shù)的青霉素溶液浸泡過的圓形濾紙片。教師引導(dǎo)學(xué)生提出所要探究的問題，如探究不同濃度的青霉素對大腸桿菌的抑菌效果，探究青霉素的使用次數(shù)對大腸桿菌耐藥性的影響等。

學(xué)生設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)如下：

①每個(gè)培養(yǎng)皿的皿底都劃分為4個(gè)區(qū)域，分別涂布第一次、第二次、第三次擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液。一個(gè)區(qū)域放置空白圓形濾紙片，其他三個(gè)區(qū)域均放置稀釋了10倍（或20倍或40倍）的青霉素浸泡并烘干的圓形濾紙片。比較三次擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液對青霉素的耐藥性的影響（圖1）。

②在培養(yǎng)皿皿底劃分四個(gè)區(qū)域，取第一次（或第二次或第三次）擴(kuò)大培養(yǎng)的大腸桿菌的菌液涂布于培養(yǎng)基中，在四個(gè)區(qū)域中分別放置空白圓形濾紙片、稀釋了10倍、20倍和40倍的青霉素浸泡并烘干的圓形濾紙片（圖2）。

為避免雜菌污染，整個(gè)接種實(shí)驗(yàn)應(yīng)該在超凈工作臺上完成。但是，生物實(shí)驗(yàn)室只有1臺超凈工作臺，無法滿足全體學(xué)生同時(shí)開展。為讓每個(gè)學(xué)生都能親歷實(shí)驗(yàn)過程，筆者嘗試在普通實(shí)驗(yàn)室，用含有體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精棉球擦拭實(shí)驗(yàn)臺面，利用酒精燈火焰周圍的無菌區(qū)代替超凈工作臺的無菌環(huán)境進(jìn)行接種。從培養(yǎng)結(jié)果來看，48h內(nèi)平板上除了接種的細(xì)菌外沒有其他雜菌生長，說明酒精燈火焰周圍無菌區(qū)完全能滿足微生物實(shí)驗(yàn)的無菌操作需求。

3 分析現(xiàn)象，小結(jié)反思

8 h后，可觀察到含有抗生素的濾紙片周圍出現(xiàn)了清晰且均勻的抑菌圈。且青霉素濃度越大，抑菌圈越明顯；擴(kuò)增代數(shù)越多，抑菌圈直徑越小。

但是，本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)了以下現(xiàn)象：①空白濾紙片周圍也出現(xiàn)了抑菌圈；②稀釋了40倍的青霉素浸泡并烘干的圓形濾紙，形成的抑菌圈反而更大；③隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，抑菌圈周圍出現(xiàn)了不規(guī)則的鋸齒狀等。因此，學(xué)生產(chǎn)生繼續(xù)研究的課題：同種抗生素對不同菌種的抑菌效果不同；同種菌種對不同抗生素的敏感程度不同等。

本次探究實(shí)驗(yàn)的意義是：微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是高中生物實(shí)驗(yàn)中開出率最低的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，很多學(xué)校由于實(shí)驗(yàn)條件的制約，實(shí)驗(yàn)僅僅停留在倒平板、模擬接種上。利用酒精燈火焰無菌區(qū)替代超凈工作臺，室溫代替恒溫箱，教師只需要提前進(jìn)行培養(yǎng)基的配制及滅菌、菌種的選育及培養(yǎng)，可就地取材、簡便易行方法獲得菌種，使學(xué)生對身邊微生物及相關(guān)事物產(chǎn)生新的認(rèn)識，增加學(xué)生動手操作的機(jī)會，從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。