酶促類蛋白反應的研究進展

李云亮，周安奇，阮思煜，馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）

類蛋白是指氨基酸單體或其衍生物通過酰胺鍵連接形成類似天然蛋白質結構的聚氨基酸[1]，可通過直接熱聚合[2]、氨基酸開環聚合法[3]等方法合成。在食品科學領域中，類蛋白可通過酶促類蛋白反應（Enzyme catalyzed plastein reactions，ECPC）形成。ECPC具體指在適宜的條件下，將濃縮的蛋白水解物在蛋白酶的作用下形成凝膠狀蛋白類物質的過程，可被認為是蛋白質水解過程的逆反應。ECPC的反應過程分為三步：a.水解反應，用酸或者蛋白酶在合適pH下對底物蛋白質進行水解；b.濃縮，利用減壓蒸餾、噴霧干燥等方式將水解后的產物進行濃縮；c.合成反應，將濃縮物，或者其他原料來源的氨基酸加入，并用蛋白酶催化反應[4-6]。

國外對ECPC的研究開展的比較早，對其反應機制、影響條件及應用等有很多的報道[7]。近些年，國內對于ECPC的研究也越來越多，該反應已經被應用于大豆蛋白[8]、乳蛋白[9]、魚酶促類蛋白[10]等改性蛋白生產中，取得了良好效果。ECPC不僅彌補了天然蛋白的氨基酸組成結構缺陷，提高了蛋白質功能性，還改善了蛋白水解物的風味，為食品行業提供了新的蛋白質來源。

鑒于ECPC的營養性、功能性和安全性等優點所體現出來的廣闊前景，本文主要概述了ECPC發生的機理，討論了影響反應的主要因素和反應產物的特性，并總結了該反應的部分用途，為更好地了解和利用該反應提供理論依據。

1 ECPC反應機理

ECPC作為蛋白酶解反應的逆反應，有關其主導機制一直存在很大爭議，目前主流的ECPC反應機制包括：物理聚合作用、縮合反應和轉肽作用，其中縮合反應和轉肽作用涉及到新肽鍵的生成，即蛋白質水解物通過類蛋白反應能生成原料蛋白質中沒有的新肽段，具有很大研究價值。

物理聚合作用：1976年，Michiko等[11]提出，疏水基之間相互作用是ECPC發生的主要原因。上世紀90年代初，Andrews等[12]使用衍生自酪蛋白的肽作為底物，研究了類蛋白合成反應的各個方面，證明該反應是一個純粹的熵驅動的物理聚集過程，物理鍵的疏水作用是整個酶促反應的關鍵步驟。曲玲玲[13]用掃描電鏡和原子力顯微鏡觀測到ECPC過程中大豆蛋白-酪蛋白復合物的形貌及尺寸均發生變化，認為疏水相互作用在大豆多肽和酪蛋白非磷酸肽的結合中起到了至關重要的作用。梁雪[14]也發現在ECPC過程中有疏水相互作用和氫鍵的參與。物理聚合作用主要涉及蛋白質高級結構的變化，但是形成的相互作用力比較弱。此外，物理聚合作用導致疏水性增加，從而更易將反應產物從反應中分離出來。

縮合和轉肽作用：有研究者認為，合成類蛋白反應是單純的動力學驅使的蛋白質水解反應的逆反應，通過酶催化多肽和氨基酸底物再次發生縮合作用，轉化成新的蛋白質或分子量較大的聚合肽。這一作用在加入端基封閉氨基酸的試驗中得到驗證，另外封閉肽的氨基比羧基對類蛋白的合成影響更大[15]，然而也有研究表明封閉肽的氨基和羧基末端只會稍微降低類蛋白的產量[9]。這表明，縮合作用在不同類蛋白反應中貢獻不一樣，也可能還有其他機制[16]。彭新顏等[7]認為ECPC實際上就是一種轉肽過程，肽鍵斷裂和形成的過程導致氨基酸殘基重排。在類蛋白反應過程中，肽分子通過轉肽的作用，將疏水性氨基酸轉化為疏水性多肽，并逐漸形成不溶于水的類蛋白產物[14]。趙謀明[6]認為，ECPC僅僅是由濃縮反應形成新的肽鍵或轉肽作用產生是不恰當的，要證明是哪一種機制占主導地位需要分析產物的平均分子量是否增加，以及生成的不溶性物質是否與分子量的增加有關。縮合和轉肽作用主要涉及的是多肽分子一級結構的變化，可通過分子標記來監測具體是哪種作用在起作用。

ECPC機制復雜，同一個反應中多種機制相互作用，要明確具體哪一種機制在反應中起主要作用仍需進一步深入研究。隨著科技的革新和進步，核磁共振、質譜、高效液相色譜等分析技術可以進一步幫助解析其機理。

2 影響ECPC條件

影響ECPC的因素很多，如酶的種類、底物濃度、反應溫度、反應pH等，選擇適宜的反應條件、控制水解反應將更有利于ECPC的進行，部分學者通過研究該反應總結出來的最適反應條件如表1所示。

表1 ECPE反應條件Table 1 Reaction condition of ECPC

2.1 酶的種類

酶是影響ECPC至關重要的因素。酶的種類有很多，通常選用內切蛋白酶，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等來進行ECPC，而較少選擇外切蛋白酶[26]，這是因為工業上采用的水解酶通常為內切酶。不同類型原料進行ECPC所適用的蛋白酶有所不同。Li等[27]在研究堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對豬血紅蛋白和肉蛋白水解物形成類蛋白反應的影響時，發現堿性蛋白酶比木瓜蛋白酶可以誘導更多的肽經過疏水相互作用聚集。周麗杰[28]通過對比胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶催化獲得的類蛋白反應產物的性質，發現經木瓜蛋白酶催化得到的修飾產物的血管緊張素轉移酶（ACE）抑制率比其他三種蛋白酶要高，達到70.37%。相同的原料在不同蛋白酶催化下獲得類蛋白產物產率也有所差異，鹿波[29]采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶分別催化酪蛋白水解物合成類蛋白，產物產率分別為71.4%和64.37%。ECPC中，水解和合成采用的酶可以一致，也可不同。兩個過程都采用一種酶可以有效減少水解作用的影響，這是因為易被水解的鍵在水解過程中已經被水解斷[6]。

整體看來，考慮到酶既具有水解蛋白又具有合成蛋白的能力，在進行合成反應的時候，則需要盡可能地減少酶的水解作用，這時就會選擇改變反應條件來調整反應的進行，由于不同蛋白酶的最適反應條件有所不同，所以需要針對不同的反應原料和反應條件選擇最為恰當的蛋白酶。比如當pH為5.0左右時，胃蛋白酶的水解能力最弱，這時以胃蛋白酶水解產物為底物，選擇胃蛋白酶催化合成反應的產物得率比其他酶要高[6]。目前，也有學者嘗試采用固定化酶來催化類蛋白反應，取得了較好的合成效果[18]。但是，關于利用復合酶制劑來催化該反應的報道比較少，很大可能是因為復合酶之間會相互影響，機制不明確，不利于ECPC的有效控制。

2.2 底物濃度

底物濃度對整個ECPC的影響很大，當反應體系中底物濃度低于7%時，ECPC進程停止，反應體系中以水解反應為主；當底物濃度逐漸增加，反應體系逐漸變為以合成反應為主[30]。王晗欣等[31]的報道證實了這一觀點，認為當底物濃度低時，會發生蛋白水解作用，導致ECPC產率下降；但是當底物濃度過高時，混合物粘性增加，阻礙了酶的催化作用，也會影響ECPC的進行。徐薇等[22]在研究底物濃度對酪蛋白水解物ECPC的影響時，發現當底物濃度超過40%時，由于黏度過大，修飾后樣品的游離氨基變化量減少，因此，該反應最適底物濃度應在7%～40%之間。相關研究表明，類蛋白合成時，底物濃度從11%～43%范圍內類蛋白產量呈線性增加[32]。酶的水解和合成能力各有不同，能適應的底物濃度范圍也有所差異，也會影響產物的合成[33]。綜上所述，在較低的底物濃度條件下，酶的水解作用起主導作用，隨著底物濃度的增加，合成作用逐漸加強，當底物濃度到達一定高度的時候，由于反應體系粘度增加，酶的運動被限制，其催化作用也被減弱。

2.3 反應溫度

反應體系溫度直接影響著蛋白酶的活性，是影響ECPC速率的關鍵因素。隨著溫度的升高，蛋白酶活性先增加后減少，ECPC產率也呈現先加快后減慢的趨勢。當溫度較低時，蛋白酶的活性受到抑制；但是溫度升高到一定程度時，蛋白酶將變性失活，同樣不利于ECPC的進行[34]。朱曉杰等[35]在研究溫度對海地瓜蛋白酶解物ECPC的影響時得出相同的結論，發現在45 ℃時，游離氨基減少速率最快，而溫度繼續升高時，游離氨基減少速率反而降低，說明溫度過高可能會導致蛋白酶失活, 不利于ECPC的進行。汪敬科[36]認為，ECPC在熱力學上是一個放熱反應，溫度升高并不能增加反應產率，低溫下更有利于平衡向生成肽鍵方向移動，但是反應溫度過低又會導致反應速率下降。從總體上來看，蛋白質的水解反應和類蛋白的合成反應的最佳溫度相差不大，其最佳的反應溫度是由反應使用的酶的特性來決定，酶的最適反應溫度決定反應的最適溫度。目前常用的酶固定化手段和改進方法，使酶的最適作用溫度提高[37]或者耐低溫等極端溫度的能力也更強[38]，有效擴寬了酶的使用范圍。

2.4 反應pH

ECPC的最適pH往往與水解反應的最適pH不同，也是影響ECPC的重要因素，如表1所示，根據水解反應的最適pH與合成反應的最適pH的差值-ΔpH，可將酶分為 3 類：胃蛋白酶型：ΔpH＞0，即合成最適pH大于水解最適pH；α-糜蛋白酶型：ΔpH＜0，即合成最適pH小于水解最適pH；中性蛋白酶型：ΔpH=0，即合成最適pH等于水解最適pH；而胰蛋白酶在任何pH范圍內均不能催化生成類蛋白產物[14]。有學者提出，每種酶在水解反應中都存在最適的pH；而在類蛋白的合成反應中卻不存在這個情況[26]，這可能是因為很多的寡肽和蛋白質的等電點都在pH 4.0～7.0范圍內。總而言之，酶的合成反應與水解反應最適宜的反應pH不同，合成反應最適的pH與水解產物的等電點密切相關。

2.5 其他

伴隨著反應的進行，蛋白酶逐漸失活，因此，反應時間也是一個影響ECPC的因素[23]。另外，反應體系中的有機溶劑也對反應有一定程度的影響。在反應體系中添加有機溶劑可以降低底物的粘度，誘導疏水性氨基酸更多地暴露出來，形成疏水相互作用從而促進反應的進行[26]。有研究表明，底物的疏水性和親水性對反應也有影響，認為隨著疏水性的增強，反應速度越快，但是，疏水性過高會對反應起不利作用，因為底物難溶于水從而無法參與反應[39]。1974年，Tanizama等[40]通過研究水含量對固定化的胰凝乳蛋白酶催化N-苯酰化-L-酪氨酸-β-硝基苯胺水解的影響，認為含水量越低越有利于反應。除此之外，底物成分也會影響反應的進行。以玉米醇溶蛋白水解物合成類蛋白時，最有效的底物主要成分是四肽、五肽和六肽，平均分子質量分別為685和1043 Da的部分是效果最好的基質[6]。向反應中添加氨基酸酯比單純增加游離氨基酸量或催化氨基酸衍生物更有利于推動反應進行[39]。綜上所述，ECPC是一個各種因素共同決定的反應，特別ECPC是一個酶催化的反應，影響酶的條件也同樣會影響反應的進行。

3 酶促類蛋白反應的產物特性

ECPC產物特性與蛋白質原料和蛋白質的水解物相比有較大差異。Bengt等[41]發現有些類蛋白反應物不溶于水、鹽酸、氫氧化鈉和3～9的pH緩沖溶液中，但是可以完全溶解于50%的乳酸或者檸檬酸溶液中，微溶于50%的乙酸溶液中。此外，Gololobov等[42]在利用α-胰蛋白酶和木瓜蛋白酶催化大豆蛋白水解時，發現水解產物不發生平均分子量的變化，但是，類蛋白反應發生后，氨基酸序列發生重排。也有研究表明，反應過程中，分子量相對較小的多肽混合物會相互作用合成大分子的肽。張雅麗等[8]以大豆蛋白水解物和芝麻蛋白水解物為底物進行ECPC，獲得了分子量約為10000 Da的類蛋白產物。孫輝等[43]利用類蛋白反應修飾酪蛋白水解物，得到的產物中也存在分子質量較大的肽分子。此外，類蛋白反應產物同樣可以被動物消化吸收。研究表明，當色氨酸通過類蛋白反應連接到水解蛋白上后，富含色氨酸的類蛋白反應物中色氨酸和游離色氨酸的生物利用率無顯著差異[33]。姚玉靜等[44]在進行大鼠喂食實驗時，發現類蛋白反應產物的消化吸收率與其他天然蛋白質并無區別。類蛋白反應通過改變蛋白水解物的多肽序列，可以有目的性地向原料蛋白中導入含硫氨基酸、色氨酸、蛋氨酸等，使產物的氨基酸組成模式更接近聯合國糧農組織和世界衛生組織推薦的必需氨基酸模式[14]。

4 酶促類蛋白的應用

4.1 蛋白質水解物的脫苦

蛋白質水解物的苦味強度受疏水氨基酸的含量、肽的分子量、水解酶的種類和水解度等多方面的影響[45]。研究表明，蛋白質水解后的苦味源于肽中大量疏水性氨基酸的暴露，如苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸等[46]。對于小麥面筋水解物而言，在前2 h內，水解反應逐漸釋放疏水性氨基酸，苦味增加；隨著反應的不斷進行，長鏈的苦味肽含量逐漸減少，苦味下降[47]。此外，當疏水性氨基酸位于C、N端時苦味較低，位于肽鏈非端基位置時，表現出的苦味最大，以游離形式存在時苦味最低[48]。蛋白質水解得到的苦味物質的多肽分子量一般低于6000 Da，500～1000 Da范圍內的肽段苦味最強[47-48]。

目前，常用的蛋白質水解物脫苦方法包括選擇性分離[49]、包埋掩蓋法[50]、ECPC法[51]和酶法脫苦[52-55]。范巍巍[56]利用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和動物蛋白酶酶解鱈魚骨頭，發現經堿性蛋白酶處理得到的產物風味最差，經木瓜蛋白酶處理后得到的酶解液苦味值最低。Synowiecki等[57]研究發現牛紅細胞的蛋白水解物與谷氨酸進行類蛋白反應，水解產物的苦味顯著降低。劉小蕾[58]利用共沸異丁醇萃取、類蛋白反應和加明膠一起酶解三種方法對豬骨湯酶解液脫苦，當類蛋白反應脫苦時，以風味蛋白酶為轉肽酶，ECPC進行2 h時，所得酶解液的苦味值最小。侯鈺柯等[16]認為蛋白水解物中的疏水性氨基酸殘基可以在類蛋白反應中被包埋聚集構成“疏水核”，從而減少蛋白質水解物的苦味。王朋等[59]利用類蛋白反應法和物化法改善蛋白水解液苦味，通過對比發現，類蛋白反應法具有無添加、無毒副作用等優點，應用前景更加廣闊。

總體來說，蛋白質的苦味主要來源于水解過程中疏水性氨基酸殘基的暴露，由于在苦味強度上, 內切酶效果要強于外切酶效果[59]，而蛋白的水解反應更多的采用的是內切酶，所以水解過程中苦味增加更加明顯，因此，蛋白水解物的脫苦就顯得尤為重要。ECPC能促進底物之間相互作用，減少了疏水性氨基酸殘基的暴露，在降低蛋白水解物苦味的問題上效果顯著。

4.2 制備活性肽，提高蛋白質的生物效價

生物活性肽是一類具有抗氧化、改善睡眠、免疫調節、抗菌和降血壓等功能小分子多肽，其制備方法主要有：從自然界生物體中直接提取、采用酶水解或微生物降解得到和通過化學方法或重組DNA技術合成生物活性肽[45]。目前常用方法是通過蛋白酶水解法來獲得生物活性肽[60-62]，但是該方法制備的產物的活性受到了原料蛋白的限制，因為無論是酶水解還是微生物降解，都是利用蛋白酶催化水解反應，對蛋白質特定位點上的酰胺鍵進行水解，獲得的肽片段與原料蛋白的氨基酸序列一致，所以無法進一步提高生物活性肽的活性。

ECPC能夠將限制性氨基酸連接到多肽中，可以有效改善肽的生物活性。目前的研究主要集中在利用該反應制備ACE抑制肽[63-64]、抗氧化肽[65]和抑菌肽，如表2所示。研究表明，通過類蛋白反應可以添加必需氨基酸或者原料中缺少的某些氨基酸，彌補原料蛋白氨基酸組成不均衡的缺陷，合成具備特定功能的蛋白質，達到改善蛋白質的營養組成，提高蛋白質生物效價的目的。高丹丹等[25]在利用木瓜蛋白酶對泥鰍蛋白進行類蛋白反應修飾，結果表明：修飾產物的抗氧化活性是修飾前的1.99倍，DPPH自由基清除率為77.98%±0.08%。同年，高丹丹等[66]在對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的ECPC修飾研究中發現，當甘氨酸作為外源氨基酸的時候修飾效果最好。Zhao等[67]兩人發現堿性蛋白酶催化的類蛋白反應不僅能改善大豆蛋白DPPH自由基清除率，還能改善大豆蛋白水解物的抗氧化性能。馬春敏等[20,68]以色氨酸為外源氨基酸，通過類蛋白反應得到乳鐵蛋白水解物（LHS），在研究中發現色氨酸修飾物對大腸桿菌的抑菌率較未修飾前提高了45.41%，純化后的色氨酸修飾物對大腸桿菌的抑菌率較未純化前提高了29.69%，將色氨酸修飾物均勻涂抹在茶腸制品上可以得到保質期更長、亞硝酸鹽含量更低的產品。在對牡蠣肽的類蛋白反應的研究中發現：疏水相互作用是類蛋白反應的主要機理，為開發安全、高效的鋅離子補充劑產品提供了新思路[69-71]。

表2 ECPC制備活性肽Table 2 Preparation of active peptides from ECPC

不僅如此，ECPC還可以增強蛋白水解物的膽汁酸結合能力[72-73]。鄭玥等[19]在探討醋蛋液水解物的類蛋白反應修飾及其對膽酸結合能力的影響時發現：ECPC可以提高醋蛋液水解物的膽酸結合能力和對蛋白酶抵抗的能力，并且結合能力最高的修飾產物的結合能力達到102.1%。梁雪[14]利用酶法合成類蛋白，與原料蛋白和水解物相比，合成的類蛋白具有更高的膽汁酸結合能力，類蛋白對牛磺膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉的結合量分別為2.31、2.23和3.05 μmol/100 mg蛋白。溫子健[18]通過大豆蛋白-乳清蛋白的類蛋白反應及其結合膽汁酸能力的研究，其結果表明，大豆蛋白-乳清蛋白的類蛋白通過疏水作用合成，能有效提高水解物膽汁酸結合能力。由此證明，ECPC可以有效提高活性或者改善產品質量。

4.3 改善蛋白質的功能性質

蛋白質水解物的功能性質主要包括水合性質（溶解性、持水性、粘度等）、乳化性和起泡性、凝膠作用和成膜性，通過ECPC，水解產物在酶的作用下產生交聯，這些性質會得到改善[79]。馮建國[17]利用胃蛋白酶催化大豆蛋白和燕麥蛋白進行類蛋白反應，測得的類蛋白在不同的pH范圍內都具有較強的功能性質，尤其是乳化性質和起泡性明顯優于原料蛋白。Jiang等[80]研究ECPC修飾小球藻ACE抑制肽的機理，通過差式掃描量熱法，發現在類蛋白反應修飾后蛋白的熱穩定性增強，并且其熱變性溫度從120 ℃增加到134 ℃。此外，以水解明膠和蛋氨酸酯為底物，通過ECPC接上氨基酸月桂酯，既可以提高其營養價值，還可以提高改性水解蛋白的乳化性和穩定性[81]。楊楊等[21]通過對大豆蛋白-酪蛋白的類蛋白反應條件進行優化，制備出營養組分更完善、成膜性更好的優質蛋白，為生產營養組分豐富、價格便宜、可降解和可食用的動植物蛋白膜提供理論依據。Willianms等[32]將ECPC應用于霉菌蛋白改性，與常見的膠凝產品蛋白質不同，以相對較差的底物合成獲得了不透明、觸變的粘性溶液。總而言之，ECPC可以選擇較為廉價的蛋白作為原料，改善其功能性質，ECPC產物在廣泛的pH范圍內具有適用性，在酸性高蛋白飲料、糖果業制造等方面有良好的應用前景。

4.4 提供新的蛋白質來源

最開始，ECPC因為可以利用海藻、微生物、葉蛋白等幾乎無成本原料而受到很多人的關注，經過進一步的研究，該反應被應用到更廣的范圍。任增超等[10]利用胃蛋白酶對羅非魚下腳料進行酶解蛋白合成類蛋白，為魚蛋白改性、開發新的蛋白資源提供了新思路。Sukarno等[82]對虎蝦消化道中蛋白酶進行研究，發現通過固定化酶進行ECPC修飾獲得的產物中，苯丙氨酸含量變得極低，得到的酶促類蛋白產品具有潛在的營養價值，可用于各種配方食品、飼料產品的營養補品，也可以用于苯丙氨酸代謝障礙患者的食品。

ECPC還可以應用于蛋白質回收，制備具有生物學功能的新型蛋白質。Udenigwe等[83]使用不同蛋白酶水解雞肉蛋白制得的水解物進行類蛋白反應，對雞肉蛋白進行回收，開發出基于肽的膽汁酸結合樹脂，用于調節高脂血癥期間的內源性脂質水平。Li等[84]利用醍魚內源性酶水解和豆粕的固態發酵生產水溶性蛋白粉，蛋白質回收率最高可達91%，為提高動物蛋白利用率提供了方法。Sun等[85]發現模擬胃腸道（GIT）消化后蛋清蛋白水解物的類蛋白反應顯著降低了其免疫球蛋白E（IgE）的結合活性，該方法可用于生產結構修飾的免疫球蛋白。

5 結語與展望

本文通過了解ECPC反應機理、性質和影響因素等方面的內容，目的是為了對ECPC有更深層次的認識，為蛋白質的深度利用和高值化提供理論基礎。鑒于ECPC能有效地降低底物的苦味值，在多肽產品的研發中可以有效起到改善產品品質和風味的作用，而且ECPC無毒副作用，且能提高蛋白質的效價，提供新蛋白來源，后續可以考慮將該反應應用于功能性食品的研發中，彌補天然食品的缺陷，滿足更多人群的營養需求。