基于網絡藥理學及分子對接技術探索清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的機制研究

朱萬青， 李偉偉， 李娟

0～14歲兒童呼吸系統疾病占兒科門診就診總數的1/4[1]。近十年來，兒童支氣管-肺系統病變的發病率增加了3.6倍，主要是以上、下呼吸道的急性和復發性炎癥性疾病為主[2-3]。急性支氣管炎的發病率也隨著增高，這使兒童門診治療變得非常復雜[4-6]。許多患者需要住院治療，對孩子和父母都造成壓力[7-9]。支氣管炎癥不受控制且反復發作的急性支氣管炎最終會導致肺功能下降，進而可能導致哮喘的發生[2,10-12]。治療上多以抗感染、化痰藥及支氣管擴張類藥物為主，但疾病易反復發作，其臨床療效往往不理想。小兒由于“臟腑嬌嫩，形氣未充”的生理特點決定了小兒肺氣常常不足，故而臨床上治療小兒支氣管炎往往采用清補肺氣的治療原則，且療效顯著。

清宣止咳顆粒是根據張珍玉教授多年臨床觀察研究而研發的中成藥，該方是由桑葉、陳皮、白芍、杏仁、紫菀、枳殼、薄荷、甘草、桔梗組成。既往研究表明，清宣止咳顆粒通過減少咳嗽模型大鼠血清中炎癥因子含量，增強機體的免疫功能，抑制氣道中炎癥因子的產生，從而可以改善咳嗽的癥狀[13]；清宣止咳顆粒可以有效減少咳嗽型小鼠模型肺部充血、炎細胞浸潤等病變的發生，進而緩解咳嗽、咳痰的癥狀[14]。在臨床診療的過程中發現，使用清宣止咳顆粒聯合治療小兒急性支氣管炎，可有效的縮短其病程，明顯改善患兒咳嗽、咳痰癥狀，臨床療效滿意[15]。

圖1 小兒支氣管炎差異表達基因的熱圖

近年來，微陣列技術越來越多地用于生命科學研究，中藥成分與疾病的關聯性、基因的生物信息學數據挖掘已廣泛用于差異表達分析。本研究通過運用生物信息學、網絡藥理學和分子對接的現代科學技術，從分子診斷到分子分類，多層次分析清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的可能潛在機制。

1 藥物活性成分篩選法

清宣止咳顆粒活性成分和潛在靶點分別以桑葉、陳皮、白芍、杏仁、紫菀、枳殼、薄荷、甘草、桔梗為關鍵詞，以類藥性指數≥0.18[16]以及口服生物利用度≥30%[17]作為篩選條件，對應的藥效成分信息在中藥系統藥理數據分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數據庫中采集。此外，在數據庫Ingredients中獲得篩選得到的清宣止咳顆粒藥物有效化學活性成分對應的靶點蛋白，并進一步在Related Targets中獲得蛋白靶點對應的疾病靶點，再通過Perl軟件篩選出無對應靶點成分，將重復靶點排除。

2 疾病核心靶點篩選

2.1 微陣列芯片下載 以“Syncytial Virus Genotypes”為關鍵詞在NCBI GEO數據庫搜索微陣列數據集，本研究下載了GSE103842數據集，本數據集描述了5個非連續呼吸季節中呼吸道合胞病毒菌株的遺傳變異性，并評估了呼吸道合胞病毒亞型、基因型和病毒量對臨床疾病嚴重程度的作用。

2.2 數據處理和差異表達基因分析 使用Perl軟件將GSE103842數據集由探針的名稱轉化為基因名，例如，當多個探針名稱與同一基因名相對應時，取該基因表達值的平均值；使用VennDiagram包對GSE103842數據集進行整合，刪除重復的、無效的基因名稱，篩選出小兒支氣管炎的靶標基因。我們再運用R軟件LIMMA包對篩選出來的小兒支氣管炎基因表達矩陣進行歸一化處理，獲取小兒支氣管炎基因的表達值，再以adjustedP<0.05和|log2 FC(fold change)|≥1作為篩選標準，篩選出數據集中小兒支氣管炎的疾病基因。

2.3 繪制韋恩圖，獲取共有靶點 使用R軟件中VennDiagram包繪制韋恩圖，篩選出清宣止咳顆粒藥物靶點預測和小兒支氣管炎的疾病基因集的共有靶點。

2.4 差異表達基因(differential expressed gene，DEG)的功能富集分析 基因本體(gene ontology，GO)提供了一個框架來描述所有生物體中基因產物的功能，并識別高通量基因組的特征生物學特性或轉錄組數據[18]。GO注釋分為三個部分：生物過程、細胞構成和分子功能。基因組數據庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)向具有高階功能信息的關鍵數據分配DEG集的特定路徑，可用于功能解釋和基因組信息的實際應用[19]。利用基因功能分析的注釋、可視化和綜合發現數據庫(https：//david.ncifcrf.gov)。David提供的分析模塊將數據轉換為加快分析基因組級數據集合的生物學意義[20]。為了揭示篩選的DEG在小兒支氣管炎進展中的生物學意義，我們使用DAVID對來自Venn包的DEG進行GO功能和KEGG通路富集分析，錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05被認為具有統計學意義。

2.5 DEGs的蛋白互作網絡圖(protein-protein interaction networks，PPI)分析，篩選核心靶點 蛋白質之間的相互作用對于理解腫瘤的代謝和分子機制至關重要。新版String 10.0數據庫覆蓋了2 000多種生物，幾乎是之前版本的兩倍[21]。以通過使用String 10.0數據平臺分析DEG PPI圖譜。在Cytoscape中導入分析的結果中導入插件使用Cytohubba已經下載安裝。以最大團中心性(maximal clique centrality，MCC)算法的前十名作為標準，篩選出基因表達網絡中具有高連通性的Hub基因。

3 分子對接

“中藥-活性成分-靶標”網絡圖中度數最高的11種活性成分與KEGG核心蛋白進行分子對接。化合物的結構來自PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，蛋白質結構來自PDB數據庫(http://www.rcsb.org)。應用MOE(molecule operating environment)軟件對蛋白質進行對接，將受體蛋白設置為半柔性對接，選擇LondondG算法，其余設置默認參數。并使用MOE軟件對分子對接分析的結果進行可視化，以獲得2D和3D圖像。

4 結果

4.1 清宣止咳顆粒組成和目標篩選結果 經篩選，目前共搜集到清宣止咳顆粒有效藥物活性成分81個,其中桑葉9個、薄荷1個、桔梗1個、紫菀1個、白芍1個、陳皮1個、甘草56個，多種藥物共有活性成分11個。將TCMSP數據庫中發現的蛋白靶點輸入到uniport數據庫中，共獲得基因靶點266個，相應的藥物靶點25個。

4.2 微陣列芯片下載及獲取疾病基因集 通過GEO數據庫以檢索式搜索到有關小兒支氣管炎的數據集GSE103842數據集總共收集了小兒支氣管炎患者和健康對照者的全血樣本，全血表達的基因使用微陣列進行檢測。本研究對GSE10384數據集進行校正和歸一化后，獲取小兒支氣管炎的基因集，基因集中共有1 732個基因，見圖1(插頁1)。并保存為“disease.txt”文本文件。

4.3 獲取藥物和疾病的共有靶標結果 采用EXCEL表將清宣止咳顆粒中發現的目標與小兒支氣管炎進行合并以明確清宣止咳顆粒與小兒支氣管炎的關系，最終得到24個交叉目標，見圖2，然后構建韋恩圖來可視化數據(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)。

圖2 清宣止咳顆粒藥物靶點與小兒支氣管炎相關發病機制靶點韋恩圖

4.4 構建“中藥-有效成分-靶向基因”網絡 利用EXCEL整合中藥靶點與疾病靶點的交叉點，得到24個靶基因，導入Cytoscape 3.7.2構建中藥-活性成分-靶點網絡。由此得到106個節點，發現812個交互關系。“中藥-有效成分-靶基因”網絡見圖3，根據靶點蛋白與藥物的關系構建“藥物-靶點-化學成分”分析發現，涉及到的疾病靶點根據度值選擇前十的基因包括蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、ATP結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)、醛酮還原酶家族1成員B1(aldo-keto reductase family 1 member B1，AKR1B1)、CD163細胞(cluster of differentiation 163，CD163)、螺旋環螺旋結構區域內擴散激酶(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase,CHUK)、絲裂原活化蛋白激酶14(recombinant mitogen activated protein kinase 14，MAPK14)、花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)。為了能夠更加直觀地探析清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的作用機制，本研究還對“藥物-成分-疾病靶點”進行網絡構建，經分析可知清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的關鍵化學成分為豆甾醇、槲皮素、刺槐素、山奈酚、菜豆素、甘草黃酮、甘草查爾酮乙、異鼠李素、木犀草素、柚皮素，見圖3。

4.5 富集過程分析結果 富集分析結果顯示在GO功能富集中，生物過程中，主要參與肽的反應、脂質定位的調節、脂蛋白顆粒的反應、細胞對脂蛋白顆粒刺激的反應、炎癥反應的細胞因子產生。在細胞構成中主要富集于管腔分泌顆粒、囊腔、轉錄調節復合物等，主要與核受體活性結合，配位體在分子功能中活化轉錄因子活性結合，RNA聚合酶Ⅱ在DNA中特異結合。蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關，脫氧核糖核酸結合轉錄因子結合是蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關見圖4。此外，在KEGG通路富集結果中，小兒支氣管炎可能與Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis、Acute myeloid leukemia、Adipocytokine signaling pathway信號通路等密切相關，見圖5。

圖3 清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的“中藥-活性成分-靶點”網絡

X軸代表被GO富集的基因的數目，Y軸代表GO功能。漸變色表示矯正后的P值。P<0.05作為顯著富集的閾值

X軸代表被KEGG富集的基因的數目，Y軸代表KEGG功能。漸變色表示矯正后的P值。P<0.05作為顯著富集的閾值

4.6 核心基因篩選 將清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎潛在作用靶點導入STRING數據庫進行在線PPI分析，交互閾值設置為“0.4”以隱藏附加型基因目標。圖中的“邊”代表交叉基因之間的關聯程度，表示關聯程度。因此，關聯越大，節點代表交叉基因的機會就越大。結果如圖6所示：度值最高的前30個靶點繪制成核心基因柱狀圖，涉及到的疾病靶點前十的包括AKT1、PPARG、STAT3、ABCA1、AHR、AKR1B1、CD163、CHUK、MAPK14、ALOX5。

4.7 核心作用靶點篩選進行分子對接 小兒支氣管炎的發病機制可能與Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis、Acute myeloid leukemia、Adipocytokine signaling pathway信號通路等免疫炎癥相關,根據KEGG信號通路富集分析結果，如表1。

圖6 清宣止咳顆粒藥物靶點與小兒支氣管炎疾病蛋白質相互作用圖

表1 核心靶點基因通路富集表

分別選取Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis,并結合網絡藥理學預測的選取的3條信號通路制作韋恩圖，如圖7所示，選取3條通路的共同的作用靶點作為關鍵靶蛋白,MAPK14、STAT3、CHUK為3條通路的共同的作用靶點,并與清宣止咳顆粒藥物成分豆甾醇、槲皮素、刺槐素、山奈酚、菜豆素、甘草黃酮、甘草查爾酮乙、異鼠李素、木犀草素、柚皮素進行分子對接。

4.8 分子對接結果 用MOE中的Dock模塊進行分子對接，選擇基于蛋白和配體間相互作用能的打分函數ASE，分別得到每個化合物與受體的對接打分，打分越低，配體與受體結合越穩定，結果見表2，總體來說，疾病核心靶點與化合物結合相對穩定，其中S值小于-7.0的有CHUK與Acacetin；STAT3與Acacetin；MAPK14與isorhamnetin。主要活性成分和核心靶點之間的結合情況與預測關系相符。現將結合能小于-7對接結果進行可視化展示，見圖8。

表2 核心靶點與藥物共同化學成分結合對接分數表能(kJ/mol)

圖7 Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis韋恩圖

3 討論

急性支氣管炎是由生物、物理、化學刺激或過敏、感染等因素引起的氣管支氣管黏膜的急性炎癥[22]，故治療多以對癥治療為主。但對于反復發作，體質較弱的嬰幼兒，中醫藥治療療效顯著。急性支氣管炎屬于中醫“咳嗽”的范疇，小兒咳嗽常急性起病，由于小兒肌膚薄嫩、易感外邪，病情易反復。清宣止咳顆粒是由張珍玉教授在民間驗方的基礎上研制而成的純中藥制劑，方中桑葉甘苦性涼，薄荷辛涼，疏風散熱共為君藥；杏仁、枳殼苦降，桔梗辛散，祛咳止痰共為臣藥；紫菀味苦溫而不熱，白芍味酸斂陰，陳皮苦溫行滯化痰共為佐藥；甘草調和諸藥為使藥。全方藥性溫和，不寒不熱，藥物組成以清宣為主，不傷及肺脾，對小兒常見的發熱、咳嗽、咽痛咽癢、鼻塞流涕均有較好療效。研究表明，清宣止咳顆粒具有鎮咳、祛痰、抗炎的藥理作用[23]。然而清宣

圖8 分子對接模式圖

止咳顆粒能夠發揮治療作用的具體細胞分子作用機制仍不明確。故本研究使用生物信息學、網絡藥理學和分子對接的方法研究清宣止咳顆粒和小兒支氣管炎的蛋白基因、有效化學成分和相關的生物過程，以探索清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎的潛在機制。

通過PPI網絡分析可知，AKT1、PPARG、STAT3、ABCA1、AHR、AKR1B1、CD163、CHUK、MAPK14、ALOX5這10種基因靶點超過所有度值的2倍中位數，這些基因靶點在網絡中起關鍵作用，提示清宣止咳顆粒活性成分與這些疾病靶點具有較高的結合活性。STAT3作用于哮喘越來越受到人們的關注，它參與了信號傳導和轉錄活蛋白的研究工作。STAT3能通過介導白細胞介素-6的免疫反應來調控Th17細胞的分化。它可以作為轉錄因子啟動靶基因轉錄，對炎性基因的蛋白質進行編碼，使蛋白質釋放出來，從而使炎性反應擴增。這是炎癥基因表達在哮喘發病機制中的基礎[24-25]。

前列腺素內過氧化物合酶MAPK又叫做環氧合酶，它是抗炎藥物的重要靶點，能減少炎癥因子的產生從而起到抗炎、解熱作用[26]。研究發現，通過調節炎癥介質，MAPK14能夠參與到調節炎癥反應的過程中來[27]。在CHUK基因編碼的復合物抑制蛋白激酶-α(IκB kinase-α，IKKα)，是核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路的一種必要調節器，而NF-κB信號通路被發現是支氣管炎過程中的一個重要的炎癥介質[28]。

通過GO富集分析發現，清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎涉及的生物過程主要參與肽的反應、脂質定位的調節、脂蛋白顆粒的反應、細胞對脂蛋白顆粒刺激的反應、炎癥反應的細胞因子產生。在細胞構成中主要富集于管腔分泌顆粒、囊腔、轉錄調節復合物等，主要與核受體活性結合，配位體在分子功能中活化轉錄因子活性結合，RNA聚合酶Ⅱ在DNA中特異結合。蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關，脫氧核糖核酸結合轉錄因子結合(deoxylnuclesacid)與蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性相關。

通過KEGG富集分析發現，小兒支氣管炎涉及的清宣止咳顆粒治療信號通路主要與Th17信號通路、NF-κB信號通路、晚期糖基化產物(advanced glycation end-products，AGE)-晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)信號通路即(AGE-RAGE)信號通路有關。

由于Th1/Th2不平衡導致的炎性細胞因子網絡不平衡在很多疾病的發生和發展中起著舉足輕重的作用[29]。經過Th17細胞的繼鑒定，Th17細胞及其細胞因子的不均衡已成為各種自身免疫性疾病及其他疾病的理論基礎。Th17和Treg細胞是Th1和Th2免疫平衡的一個重要補充。Th1/Th2的不平衡與其本身免疫疾病有著密切的關系[30-31]。

Th17主要是通過白細胞介素-22、白細胞介素-17等細胞因子的分泌，對防御細胞外細菌感染、介導本身免疫性病癥具有重要意義。其中，分子最多的是白細胞介素-17。該系統由誘導炎性細胞的局部浸潤，例如白細胞介素-22，導致組織破壞。在機體免疫系統中，Treg細胞是負調節的。他們不但對不適當的免疫反應起到抑制作用，而且在免疫反應的范圍、反應程度和持續的免疫反應方面也扮演著重要角色，白細胞介素-6、白細胞介素-23和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)激活STAT3可誘導Th17分化和白細胞介素-17細胞因子產生。此外，STAT3還與維甲酸相關孤核受體γt(retinoid-related orphan receptor gamma t，RoRγt)協同對Th17細胞及其功能進行了穩定[32-33]。激活STAT3是白細胞介素-6調節Th17分化所必需的，通過提高RoRγt和RoRα的表達，STAT3能夠促進Th17細胞亞群的分化。并在其增殖過程中起著重要的作用，表達細胞因子。

MAPK14、STAT3、CHUK是根據KEGG富集分析出的與AGE-RAGE、NF-κB信號通路相關的靶點。AGE-RAGE信號通路參與了支氣管上皮細胞TGF-1和NF-2分泌的尼古丁調控[34]。對支氣管炎發生、發展進行調控；在調節炎癥的過程中，NF-κB是一個關鍵的因素。轉錄因子NF-κB在全身性炎癥中進行了研究，并已在支氣管患者中發現。在滅活狀態下，NF-κB位于胞質溶膠中并與抑制蛋白kappa B(inhibitor of NF-κB，IκB)復合。IκB β僅被某些刺激物磷酸化，包括脂多糖和白細胞介素-1β，而IκB α磷酸化由大多數NF-κB激活劑觸發。在呼吸道上皮受多種細胞外刺激作用的受體時，即激活IκB激酶(IκB kinase，IKK)[35]。因此，NF-κB通路產生的細胞因子在炎癥細胞遷移中發揮重要作用，并在小兒支氣管炎發展過程中加強氧化應激，進一步加重病情。

分子對接結果顯示，清宣止咳顆粒中的活性成分槲皮素、刺槐素、異鼠李素、山奈酚與蛋白質有較強的結合性。槲皮素具有抗炎、抗氧化作用，既往研究證實，槲皮素則可通過減少氧化應激、調控基質金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)和MMP-12的表達來防止呼吸道炎癥的進展。槲皮素還可通過多種途徑來抑制肺炎鏈球菌的感染[36]。劉萍等[37]研究表明槲皮素能保護支氣管上皮細胞的作用機制可能與NF-κB信號通路相關。有研究表明山奈酚對銅綠假單胞菌、幽門螺旋桿菌等致病菌有較好的治療作用，同時對登革熱病毒及腦炎病毒有抑制作用，這與它能刺激NF-κB信號通路，增加白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子的表達下調白細胞介素-6有關[38-41]。研究還顯示異鼠李素對金黃色葡萄球菌及鏈球菌有顯著的抑制作用[42]。刺槐素是一種天然黃酮類化合物,研究表明，刺槐素可通過抑制Srt A活性,降低金黃色葡萄球菌毒力，提高金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率,降低金黃色葡萄球菌感染小鼠腎膿腫模型中腎臟膿腫程度[43]。

綜上所述，清宣止咳顆粒治療小兒支氣管炎主要的活性成分為槲皮素、異鼠李素、刺槐素、山奈酚等，通過調控Th17信號通路、NF-κB信號通路、AGE-RAGE信號通路等炎癥信號通路，作用于MAPK14、STAT3、CHUK靶點，從而起到抗炎、保護支氣管平滑肌的作用，改善支氣管炎的臨床癥狀。

4 結論

總之，本研究證明了基于網絡藥理學方法治療小兒支氣管炎的潛在清宣止咳顆粒效應機制。我們揭示了槲皮素、刺槐素、異鼠李素和山奈酚通過影響STAT3、MAPK14、CHUK等因子在小兒支氣管炎中起關鍵作用。此外，我們的分子對接研究還表明，清宣止咳顆粒的主要活性成分(槲皮素、刺槐素、異鼠李素、山奈酚)可以與STAT3、MAPK14、CHUK很好地對接，為進一步研究提供了重要依據。然而，這項研究也有一定的局限性，因為藥理學和臨床研究仍需要進一步驗證我們的發現。