抗生素發酵工藝控制和染菌分析

鄭向偉 郭俊浩

（山東魯抗醫藥股份有限公司，山東濟寧 272500）

0.引言

通常情況下在進行抗生素生產時采用了微生物的純種培養方式，在培養期間只允許特定的微生物進行生長和發育。如果發酵期間除抗生素以外產生了其他的菌種或出現了其他的微生物，就會發生染菌反應，會對抗生素的生長質量和整體的產量產生不良影響。在進行抗生素發酵生產時，因為操作環節比較復雜，及其容易出現染菌的情況[1]。要想對生產環節進行有效的控制就要對導致染菌問題發生的原因進行全面的查找，并且制訂針對性的防控措施，才能進一步提高生產的水平。

1.抗生素發酵工藝的控制技術

1.1 做好日常的檢查

（1）平板劃線及顯微鏡檢查。目前在對相關問題進行檢查時存在多種技術方法，只有及時發現污染源才能避免因為這項事故的不斷蔓延，導致損失問題變得更加嚴重。因此在對污染問題進行判斷和檢查的過程中，需要選擇合適的技術和方法才能縮短這項工作的開展時間。比較常用的方法主要存在平板劃線培養以及顯微鏡檢查技術、肉湯培養檢查技術。其中的平板劃線培養技術在應用時是將已經經過滅菌處理的固體培養基，導入到滅菌的平板中，再放置培養箱中，保持37℃的試驗溫度。在對其保溫24h之后，如果檢查不存在細菌等問題，就可以正常使用。在對樣品進行檢查期間，首先要在無菌的平板上進行劃線操作，并且將其分別設置在27℃和37℃的環境中進行培養，確保樣品能夠適用低溫菌和嗜中菌的生長環境。一般需要對樣品進行8h的觀察，但這種檢測方式的準確度比較低。生產人員要保證培養基的pH數值在7.0左右，還需要在其中設置1.0%的牛肉膏和0.5%的葡萄糖以及1.0%的瓊脂、0.5%的氯化鈉、1.0%的蛋白胨。如果采用顯微鏡的檢查方法進行相關的操作，通常要對其進行革蘭氏的染色，染色之后需要在高倍的顯微鏡下進行有效的觀察，并且根據生產菌和雜菌的主要特征，對其進行有效的分別，并且判斷是否出現污染的現象[2]。

（2）肉湯培養檢查。在進行肉湯培養檢查技術應用時，要將需要檢查的樣品倒入培養基中，并且對其進行檢查，要保證肉湯培養基中不存在菌體，還要控制到27℃和37℃的溫度下，分別進行培養。培養24h之后對其進行有效的觀察，并且開展取樣操作。這種方法經常作用于培養基和無菌空氣是否存在菌體反應的檢查過程中，并且將生產菌作為主要的指示菌進行相關的操作。在進行操作的過程中，主要存在葡萄糖酚紅肉湯培養基，要將pH值控制在7.2左右，還要設置0.5%的葡萄糖和0.3%的牛肉膏以及0.8%的蛋白棟、0.4%的酚紅溶液、0.5%的葡萄糖。在進行實際檢測時，如果采用以上方法都未發現，培養基中存在污染源，也不能判定未被污染。除上述技術方法之外，還可以從發酵期間是否存在異?，F象，對污染問題的發生進行準確的判斷，例如溶解氧出現了劇烈的變化，pH數值的波動速度比較快，排氣中的二氧化碳含量比較高或者菌體酶的活力比較旺盛。大多數情況下在發酵培養基因中使用玉米漿或者酵母粉進行相關的配置，這些物料中的菌體含量比較大，在顯微鏡設備下難以進行有效的觀察和判斷。在具體實施時要遵循相應的原則，如果培養基出現了污染現象，則菌體會呈現上升的趨勢，但如果菌體的數量增加數量比較少，與培養基中所含菌的形態保持一致，則可以判斷未存在污染的事件[3]。

1.2 準確判斷導致這項問題發生的原因

在對污染時間和程度進行判定時，必須保證判斷結果的精確性。無論是接種之前還是接種之后出現了污染，無論是補料之前還是補料之后出現的污染都要對污染源的品種和具體的發生時間進行準確的判斷，還要查找是哪批料出現了問題，要明確具體的菌型，才能對其進行有效的防控。一般情況下在進行取樣操作時，要在實驗的環境下進行處理，避免出現誤差的問題。生產人員可以適當地增加取樣的數量和頻率，特別是在進行批量判斷時，如果內部的情況比較復雜，要增加取樣的頻率，為判斷工作的開展提供有效的依據。要想明確這項問題的具體發生原因，生產人員還要對污染問題的發生原因進行全面的總結，要從根源上對這項問題進行扼殺。這項問題的發生，會受到多種因素的影響，但主要的原因是因為操作設備出現了泄漏或者在進行滅菌操作時存在失誤以及現有的技術更新速度比較慢、無菌空氣環境中存在有效的菌種[4]。一般情況下在發生污染問題之后需要利用顯微鏡設備，對培養基無菌斜面和肉湯進行全面的觀察，并且對導致相關問題發生的原因進行有效的判斷，并根據原因制定相應的解決措施，杜絕污染問題的發生。

也可以根據污染的時間對問題進行有效的判斷，早期可能是因為種子存在細菌，在對設備和培養基進行滅菌操作時，沒有對其進行徹底的處理或者接種出現了失誤，無菌空氣中出現了菌體，導致發酵后期出現了污染問題。中間補料存在污染和設備的泄漏以及生產人員的操作失誤也會引發相應的問題。種子帶菌是因為在進行了種子制作時，無菌樣品和使用之后的剩余樣品存在菌體。在對樣品進行監測時，沒有對所有的樣品進行有效的處理，一些帶菌體的種子帶入操作環節會產生球菌，球菌會因為搖瓶培養基未進行滅菌處理而出現污染問題。下在對原料進行更換時，一次只夠換一種類型的原料，其中就會引發大規模的污染現象。如果一直沿用傳統的生產工藝，無法對其全面的消除，使用搖瓶比較大的樣品進行有效的處理，在未完全驗證的情況下，需要引進更加先進的工藝進行滅菌處理。但如果搖瓶裝量比較大，升溫速度慢，就會導致培養基內部出現污染問題。在對種子的無菌樣品進行監測時，如果發現樣品都處于正常的狀態，需要對其他生產環節進行監測。一級種子罐中的污染問題，是因為未對其進行完全的檢驗就帶入到發酵罐中，一般15h的時間內發酵罐就會出現污染問題。種子罐的無菌斜面可以通過鏡檢，對是否存在污染問題進行分析和判斷。在對培養基和設備進行

滅菌操作時，如果未嚴格按照生產工藝的要求，對其進行有效的處理，就可能引發芽孢等現象[5]。因為無菌樣品在使用的過程中極易出現污染問題，在進行設備應用時，冷卻設備出現了泄漏的問題，蛇形管和連消的裝置、噴淋冷卻器存在穿孔現象或者夾層存在老化或者故障問題，也會引發污染現象，而污染現象的發生程度，與泄露的情況存在一定的聯系。

2.染菌問題的發生原因

2.1 一級種子管接種存在缺陷

在進行火焰接種時，會導致一級種子罐內部出現污染問題。在進行接種處理時，生產人員沒有嚴格按照相應的要求進行環境的消毒，生產人員和消毒人員也沒有進行密切的配合，保證各項操作的迅速完成，就會出現接種失敗的問題[6]。

2.2 蒸汽質量比較差

這項操作在實施的過程中會受到各種因素的影響，因為蒸汽質量的波動幅度比較大，內部可能會存在冷凝水問題，且總蒸汽壓力比較低。一旦壓力出現了驟然上升或者下降的問題都會對環境溫度產生一定的影響，引發濕飽和蒸汽。在這種情況下無法對其進行有效的處理，會引發比較嚴重的污染問題[7]。

2.3 空氣系統存在缺陷

過濾器設備在應用的過程中出現性能降低等問題，是因為污染問題的發生導致空氣系統中存在有效的菌體。在進行空氣過濾器設備安裝時，選用的設備質量比較低或者高效濾芯的安裝質量比較差，無菌環境中存在水分都會引發比較嚴重的污染問題。無菌環境中的油分大多是出自復式空氣壓縮機設備。在對污染問題進行排查時要對無油潤滑空壓機設備進行有效的檢查[8]。

3.染菌問題的防控措施

3.1 一級種子管接種缺陷防控措施

在進行接種處理時，可以采用零磅接種或者壓差接種等技術，利用零磅接種技術進行相關操作時，罐壓的瞬時速度為零時，外界的空氣可能會從接種處進入到內部引發污染問題，因此要提高接種區域的潔凈度，可以將接種區域與其他區域進行有效的隔離。生產人員要保證罐內的衛生，還要保證實驗內部始終處于密封的狀態，每次進行接種處理之前要先開展消毒操作[9]。

3.2 蒸汽質量差防控措施

在生產時間允許的情況下，可以通過空消技術的應用對蒸汽中的冷凝水進行有效的排除。如果蒸汽環境處于干燥的狀態，可以進行滅菌處理。在進行滅菌操作時，要開啟所有的的冷凝水閥門設備，排除內部的冷凝水之后，要保證蒸汽中的含水量不斷減少，再進罐處理。但這種技術屬于應急方案，要想從根本上對問題進行消除，還需要對蒸汽鍋爐設備的性能進行改良，要對容量和管路進行合理的設計和安裝，還要做好管道的保溫處理。在對管路進行安裝時不能直接連接非消毒的設施，例如采暖設備等，避免管道之間的相互傳播。

3.3 空氣系統缺陷防控措施

在對這項問題進行預防時，首先要添加除油或者除水設備，要選擇性能更加優越的設備類型，還要做好定期的排水處理，尤其是周邊濕度比較大時，要提升排水的速率?？梢赃x擇無油潤滑的空壓機設備，從根源上對這項問題進行有效的防控。如果無法對設備性能進行有效的改造，可以在空氣過濾器設備上增加玻璃棉或者活性炭，減少油霧的阻力。在對過濾器熱備的濾芯進行選擇時，要盡可能選擇比較可靠的生產商進行產品的購買，還要選擇更加先進的檢測儀器和技術方法，對濾芯是否存在失效的問題進行準確的判斷。在對高效過濾器設備進行安裝時，要對滅菌管路進行減壓或者粗略的處理，還要在進出口管路上進行監測設備的安裝。要對各項構件的尺寸是否合適進行全面的檢查，還要對發酵環節的生產程序進行優化處理。

4.結語

我國當前在進行抗生素發酵技術研發和試驗的過程中，已經根據染菌問題的發生制定了針對性的防控技術，生產人員也對這項工作進行了高度的重視。但實際上在對發酵生產進行防控時，要從每一個環節開始進行預防。生產人員不僅要做好常規的檢查工作，還需要在原有工藝技術的基礎上對其進行持續的優化和完善，要提高綜合的生產水平才能對生產期間存在的各項缺陷問題進行有效的控制。在我國發酵工藝不斷發展的現階段，一些新型的技術已經應用到發酵生產中，為整個行業的健康發展奠定了良好的基礎。