Tet調(diào)控Th17∕Treg細(xì)胞分化參與自身免疫性疾病發(fā)病的研究進(jìn)展

姜冠桐 周瑾 薛海波 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，濱州 56603； 煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院內(nèi)分泌科，煙臺(tái)64000

通信作者：薛海波，Email：xuehaibo@sina.com

CD4+T 細(xì)胞在自身免疫性疾?。╝utoimmune diseasas，AID）發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）在T細(xì)胞亞群中也起著關(guān)鍵作用。Th17通過產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）發(fā)揮促炎作用，而Treg 對(duì)于抑制炎性反應(yīng)及維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。大量研究證實(shí)，Th17∕Treg平衡失調(diào)與多種AID發(fā)生關(guān)系密切，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）以及自身免疫甲狀腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）等。Tet 是Fe2+和氧戊二酸依賴性雙加氧酶，其家族蛋白包括Tet1、Tet2 和Tet3，研究證實(shí)Tet 蛋白通過DNA 去甲基化調(diào)控Th17 及Treg 細(xì)胞分化參與免疫炎性反應(yīng)的發(fā)生［1-2］。本文就AID中Tet對(duì)Th17∕Treg平衡調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

Th17、Treg細(xì)胞分化

在自身免疫炎性反應(yīng)中，CD4+T 細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子、聚集其他先天免疫細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞裂解導(dǎo)致機(jī)體炎癥性疾病。在T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）被激活后，CD4+T 細(xì)胞可以分化成Th1、Th2、Th17、濾泡輔助T 細(xì)胞（T follicular helper，Tfh）和Treg等不同的T細(xì)胞亞群［1］，其中Th17∕Treg細(xì)胞免疫平衡為近年研究的熱點(diǎn)。

1、Th17

Th17的特征在于視黃酸相關(guān)孤兒受體（ROR）γt轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)［2］并產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子IL-17A。其分化及穩(wěn)定表達(dá)受多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路的調(diào)控。炎癥因子以及轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction andactivator of transcription 3，STAT3），從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子RORγt 的表達(dá)并促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化和成熟［3］。其次，由Th17 產(chǎn)生的其他細(xì)胞因子IL-2 與TGF-β 可參與Th17 細(xì)胞分化的微環(huán)境組分共同誘導(dǎo)Th17 分化，以正反饋的方式進(jìn)一步促進(jìn)這一過程［4-5］。

2、Treg

Treg 具有高表達(dá)的CD25 和特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒P3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3）［6］，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Treg可分為天然型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（natural Treg，nTreg）或稱胸腺產(chǎn)生的胸腺調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（hymus regulatory T cell，tTreg）、外周產(chǎn)生的 外周調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（peripheral regulatory T cell，pTreg）和細(xì)胞培養(yǎng)物中TGF-β誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞（induced regulatory T，iTreg）。Shevach 和Thornton［7］的小鼠研究證明，tTregs 通過遞送與GARP 結(jié)合的TGF-β 來啟動(dòng)感染耐受性，從而產(chǎn)生抗原特異性pTregs，而iTregs 通過多種機(jī)制抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的活化。Treg 細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子包括IL-10，TGF-β 和IL-35有助于免疫抑制、抑制自身免疫性疾病以及慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

Th17/Treg平衡

Th17 和Treg 細(xì)胞分化由TGF-β 介導(dǎo)的共同信號(hào)通路調(diào)控，Th17 能夠促炎性反應(yīng)，而Treg 通過產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-35 以及TGF-β 等抑制多種免疫細(xì)胞的活性進(jìn)而誘導(dǎo)免疫耐受，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此，這兩個(gè)作用相反的CD4+T細(xì)胞亞群的免疫失衡參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。

1、Th17∕Treg平衡調(diào)節(jié)

Th17∕Treg 平衡受多種信號(hào)通路、微生物群、代謝、Foxp3 的穩(wěn)定性等調(diào)控。IL-6 與TGF-β 一起誘導(dǎo)Th17 分化，同時(shí)IL-6 抑制TGF-β 誘導(dǎo)的Treg 分化［8］；Takeuchi 等［9］通過對(duì)自發(fā)型AID 小鼠模型（SKG 小鼠）實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TCR 信號(hào)異?？稍诓煌潭壬嫌绊慣h17 和Treg 的發(fā)育和功能從而引起多種免疫疾??；Cluxton 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解和脂肪酸合成能夠促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化，而Treg 細(xì)胞分化更依賴于糖酵解和氧化磷酸化，考慮抑制糖酵解或脂肪酸合成會(huì)使Th17∕Treg 軸向Treg 移動(dòng)。另外，Westfall 等［11］用來自30 多個(gè)人類供體的糞便微生物群定植無菌小鼠，證明了IBD 供體的人類腸道微生物群可導(dǎo)致Th17∕Treg 平衡失調(diào)。

2、Th17∕Treg平衡與AID

目前越來越多的研究證實(shí)多種AID 是由Th17 驅(qū)動(dòng)并由Treg 抑制的。Paradowska-Gorycka 等［12］通過對(duì)45 名RA患者、27 名骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者和46 名健康對(duì)照組研究發(fā)現(xiàn)，OA 患者中Th17 細(xì)胞比例是Treg 細(xì)胞的5～6 倍，證實(shí)Th17∕Treg 細(xì)胞失衡與RA 患者關(guān)節(jié)的自身免疫、慢性炎癥和關(guān)節(jié)破壞有關(guān)。Yan 等［13］研究報(bào)道，Th17∕Treg細(xì)胞軸的失衡會(huì)導(dǎo)致IBD 的發(fā)生，Th17 通過促炎細(xì)胞因子加劇腸道炎性反應(yīng)，Treg 比例的減少可能是IBD 發(fā)病機(jī)制的核心環(huán)節(jié)。Yuliasih 等［14］在30 名SLE 女性患者中的研究發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，SLE 患者中Th17 比例明顯升高，而Treg 比例相對(duì)較低。另外，多項(xiàng)研究證實(shí)，Th17 和Tregs 的平衡失調(diào)可參與甲狀腺自身免疫損傷，與AITD 發(fā)生、發(fā)展及疾病的嚴(yán)重程度關(guān)系密切［15-17］。

Tet蛋白介導(dǎo)DNA去甲基化

DNA 甲基化是一種表觀遺傳因素，在胚胎發(fā)育和許多疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Tet蛋白是一種去甲基化酶，自發(fā)現(xiàn)至今仍為研究熱點(diǎn)之一。Tet 蛋白能夠催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）進(jìn)一步氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）、5-醛基胞嘧啶（5-fC）至5-羧基胞嘧啶（5-caC）［18］。Tet蛋白介導(dǎo)的5-mC 氧化可以通過促進(jìn)活性DNA 去甲基化和被動(dòng)DNA 甲基化稀釋來動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)全局或位點(diǎn)特異性5-mC 和∕或5-hmC 水平，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Tet 蛋白家族包括Tet1、Tet2、Tet3，并且具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。

Tet1是介導(dǎo)DNA 去甲基化的關(guān)鍵因素。Tet1對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的分化也至關(guān)重要，并且在不同腫瘤中可與不同的信號(hào)通路相結(jié)合，起著抗癌或致癌作用［19］。Sun 等［20］通過對(duì)敲除Tet1 基因的小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎干細(xì)胞中Tet1 可調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子基因啟動(dòng)子區(qū)域中的5-hmC，從而激活巨噬細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥性疾病的發(fā)生。Tet2 的突變和失調(diào)導(dǎo)致血液系統(tǒng)多種惡性腫瘤的發(fā)展［21］。此外，關(guān)于Tet2 通過促進(jìn)DNA 去甲基化在慢性炎癥及先天免疫中的作用也已開展了多項(xiàng)研究［22］。Montagner 等［23］報(bào)道，Tet2 是肥大細(xì)胞分化和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)，在沒有Tet2 的情況下，肥大細(xì)胞表現(xiàn)為基因表達(dá)中斷和全基因組5-hmC 沉積的改變，雖然實(shí)驗(yàn)證實(shí)在沒有Tet2 的情況下，Tet 家族的其他成員仍可以調(diào)控肥大細(xì)胞的分化，但其增殖卻是僅依賴于Tet2 的表達(dá)。Tet3 在包括造血細(xì)胞在內(nèi)的體細(xì)胞中也有大量表達(dá)，但與Tet2 不同的是，Tet1 和Tet3 均具有N 端CXXC DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Lio 等［24］通過敲除Tet2∕Tet3 后的小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tet2 和Tet3 通過調(diào)節(jié)Igκ 輕鏈的轉(zhuǎn)錄和重排，并與B 細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用以促進(jìn)DNA 去甲基化和B 細(xì)胞增強(qiáng)子的染色質(zhì)可及性，證實(shí)在B 細(xì)胞分化過程中，Tet2和Tet3協(xié)調(diào)B細(xì)胞成熟和功能。

Tet調(diào)控Th17/Treg平衡

在被抗原激活后，CD4+T 細(xì)胞分化成包括Th1、Th2、Th17和iTreg細(xì)胞的輔助T細(xì)胞的不同亞群之一，Tet介導(dǎo)的活性DNA 去甲基化是調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞功能的基本表觀遺傳機(jī)制。

1、Tet調(diào)控Th17細(xì)胞分化和功能

如前所述，Tet 蛋白通過將5-mC 轉(zhuǎn)化為5-hmC 來改變DNA 的甲基化狀態(tài)。Ichiyama 等［25］通過分析各種Th 細(xì)胞中5-hmC 的全基因組圖譜發(fā)現(xiàn)，5-hmC 存在于Th 細(xì)胞亞群特異性基因的假定調(diào)節(jié)元件中。同時(shí)他們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Tet2 的缺失抑制了Th17 細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Tet2 在Treg 的非編碼序列（CNS）2 與IL-17a啟動(dòng)子區(qū)域中的關(guān)聯(lián)與這些位點(diǎn)存在5-hmC 相關(guān)。另外證實(shí)，Tet2 在Th17 細(xì)胞中以RORγt依賴性方式誘導(dǎo)IL-17 位點(diǎn)的DNA去甲基化來調(diào)控Th17∕Treg平衡。

2、Tet調(diào)控Foxp3穩(wěn)定表達(dá)及Treg細(xì)胞分化

Hori 等［26］證實(shí)，F(xiàn)oxp3 是Treg 細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)Foxp3 的Treg 在維持自身耐受和免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［27］。基因序列分析顯示Foxp3 基因座中有3 個(gè)高度保守的非編碼序列（CNS）元件，其受到表觀遺傳修飾的影響并參 與 調(diào) 節(jié)Foxp3 轉(zhuǎn) 錄 進(jìn) 而 影 響Treg∕Th17 細(xì) 胞 平 衡［28］。Zheng 等［29］發(fā) 現(xiàn)，CNS1 僅 在 外 周CD4+T 中 發(fā) 揮 誘 導(dǎo)Foxp3 的作用，CNS2 通過去甲基化維持Foxp3 表達(dá)的穩(wěn)定性，而CNS3能夠有效增加CD4+T細(xì)胞在胸腺和外周分化過程中Foxp3基因表達(dá)。

表觀遺傳變化在建立和維持Treg細(xì)胞分化及維持其穩(wěn)定表達(dá)發(fā)揮著關(guān)鍵作用［30］，F(xiàn)oxp3 表達(dá)的穩(wěn)定性與CNS1 和CNS2 的去甲基化狀態(tài)密切相關(guān)。在胸腺中的Treg 細(xì)胞發(fā)育過程中，Tet 蛋白介導(dǎo)Treg 細(xì)胞特異性低甲基化區(qū)域中5-mC的損失，其中主要表現(xiàn)在Foxp3位點(diǎn)中CNS1和CNS2。

Nakatsukasa 等［31］研究證實(shí)，Treg 中的Tet2∕Tet3 缺乏可導(dǎo)致小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+T 細(xì)胞的過度增殖，并在Foxp3 上游增強(qiáng)子中發(fā)現(xiàn)了新的Tet 依賴性去甲基化位點(diǎn)CpG，這可能有助于穩(wěn)定的Foxp3 表達(dá)。同時(shí)證實(shí)，Tet 蛋白調(diào)節(jié)成熟Tregs 中的Foxp3 穩(wěn)定性，使CD4+T 向Th17細(xì)胞分化從而導(dǎo)致Th17∕Treg細(xì)胞平衡失調(diào)。

有研究在小鼠中特異性敲除Tet2 和Tet3 后發(fā)現(xiàn)，Treg中缺乏Tet2 和Tet3 的小鼠較正常小鼠存活時(shí)間短，小部分存活時(shí)間較長的小鼠表現(xiàn)出脾大及淋巴結(jié)腫大［32］。流式細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Tet 功能喪失小鼠的Treg 與野生型小鼠Treg相比，F(xiàn)oxp3 中CNS1 和CNS2 增強(qiáng)子的甲基化增加導(dǎo)致Foxp3 表達(dá)的穩(wěn)定性降低，進(jìn)而導(dǎo)致Treg 細(xì)胞功能受損，同時(shí)Tet2∕Tet3 缺乏導(dǎo)致Tfh 和∕或Th17 細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)增加。

所有Tet 家族成員很可能在CNS2 去甲基化和Foxp3 穩(wěn)定性中協(xié)同發(fā)揮作用，因?yàn)門et1∕Tet2雙缺陷的Tregs也具有增加CNS2甲基化進(jìn)而導(dǎo)致Treg穩(wěn)定性和功能性的喪失，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥和自身免疫損傷的增加。有研究報(bào)道，硫化氫（H2S）是Foxp3+Treg 細(xì)胞分化和功能所必需的，并且證實(shí)H2S 通過硫酸化核轉(zhuǎn)錄因子Y 亞基β（NFYB）來維持Tet1 和Tet2 的 表 達(dá) 以 促 進(jìn) 其 與Tet1 和Tet2 啟 動(dòng) 子 的 結(jié) 合［33］。Tet1 和Tet2 催化Foxp3 中5-mC 轉(zhuǎn)化為5-hmC，以建立Treg特異性低甲基化模式和穩(wěn)定的Foxp3 表達(dá)。因此，Tet1 和Tet2缺失導(dǎo)致Foxp3高甲基化、Treg細(xì)胞分化和功能受損以及Th17∕Treg 平衡失調(diào)，最終參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

Someya 等［34］研究證實(shí)，F(xiàn)oxp3 在tTregs 中的表達(dá)通過Foxp3 位點(diǎn)CNS2 區(qū)域的CpG 島的去甲基化來穩(wěn)定，因?yàn)镃NS2 的去甲基化導(dǎo)致各種轉(zhuǎn)錄因子的募集，而Foxp3 在iTregs 中的不穩(wěn)定表達(dá)被認(rèn)為與CNS2 的強(qiáng)甲基化有關(guān)，但目前有關(guān)于CpG 島功能的研究尚未完全闡明。同時(shí)他們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧條件（5%的氧濃度）增加了小鼠CD4+T 細(xì)胞中所有Tet mRNA 的表達(dá)水平，進(jìn)一步保證了小鼠體內(nèi)Foxp3穩(wěn)定性和更高的抑制活性。另外，保證機(jī)體的氧供給對(duì)于Tet 酶活性也很重要，因?yàn)?-mC 的羥基化需要氧氣的參與。

有研究發(fā)現(xiàn)，Tet蛋白介導(dǎo)Treg 細(xì)胞特異性低甲基化區(qū)域中5-mC 的損失，維生素C 促進(jìn)人Foxp3 的CNS2 中5-mC損失，增強(qiáng)iTreg 細(xì)胞的穩(wěn)定性［35］。維生素C 能夠增強(qiáng)Tet活性并通過Tet2∕Tet3 發(fā)揮作用，同時(shí)增加TGF-β 誘導(dǎo)的T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)的穩(wěn)定性，進(jìn)而誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，維生素C 以Tet2 依賴性方式誘導(dǎo)Tregs 中 的CNS2 去 甲 基 化［36］。在 使 用 維 生 素C 培 養(yǎng) 的iTregs 中，5-mC 轉(zhuǎn) 化 為5-hmC 的 效 率 更 高，F(xiàn)oxp3 中CNS2 的CpG 的甲基被迅速擦除，但在對(duì)照組中則沒有這種現(xiàn)象。因此，維生素C 也是Tet 蛋白介導(dǎo)的CNS2 去甲基化所必需的，對(duì)Foxp3穩(wěn)定表達(dá)以及Treg細(xì)胞分化至關(guān)重要。

綜上所述，F(xiàn)oxp3 中CNS2 的DNA 去甲基化對(duì)Tregs 分化成熟起重要的作用，而Tet 蛋白通過影響Treg 細(xì)胞中的Foxp3 穩(wěn)定表達(dá)調(diào)控Treg 和Th17 的細(xì)胞分化和功能。T 細(xì)胞Tet2∕Tet3 或Tet1∕Tet2 缺失會(huì)導(dǎo)致CNS2 去甲基化受損和Foxp3 穩(wěn)定性降低，進(jìn)而抑制CD4+T 細(xì)胞向Treg 細(xì)胞的分化，反而向Th17 細(xì)胞分化成熟，最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)Th17∕Treg細(xì)胞免疫平衡失調(diào)，進(jìn)而參與一系列慢性炎性反應(yīng)及AID的發(fā)生、發(fā)展。

結(jié) 語

Treg∕Th17細(xì)胞平衡失調(diào)是多種AID、慢性炎性反應(yīng)、腫瘤等發(fā)生的基礎(chǔ)，而表觀遺傳變化導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)細(xì)胞基因表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致免疫耐受喪失、炎癥和自身免疫。維生素C和∕或低氧條件下能夠使機(jī)體內(nèi)的Tet蛋白穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)使CD4+T 細(xì)胞趨向Treg 分化，更為重要的是，Tet 通過DNA去甲基化調(diào)控Foxp3的穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)而改變Th17∕Treg細(xì)胞平衡參與自身免疫性疾病的發(fā)生。因此，針對(duì)Tet的深入研究可能為自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的闡明以及疾病防治提供新的思路及方向。