體素內不相干運動評估膠質瘤分級及其與Ki-67指數相關性研究

朱敏 鄧克學 邱俊 劉鈺嬋

腦膠質瘤是成人顱內最常見的惡性原發性中樞神經系統腫瘤，呈侵襲性生長，根據2016年世界衛生組織(WHO)的標準可分為四個等級,Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤[1]。膠質瘤病人的術前分級對臨床決策、療效及預后評估尤為重要。從影像學檢查來看，腫瘤可分為瘤體區和瘤周水腫區，瘤周水腫區是侵襲性腫瘤細胞和血管生成性水腫的組合[2]。常規形態學MRI對瘤周水腫是否有腫瘤浸潤的評估有限，高級別膠質瘤的范圍往往超出了強化區域，常規MRI很難完全判斷膠質瘤的侵襲性。Ki-67是反應腫瘤增殖的標志物，在許多腫瘤的研究中顯示與預后有關。本研究通過分析膠質瘤瘤體區及瘤周水腫區IVIM參數，并討論其與Ki-67標記指數的相關性，了解IVIM技術對膠質瘤分級診斷價值。

對象與方法

一、對象

2019年4月～2020年12月我院收治的腦膠質瘤病人51例，男27例，女24例，年齡24～76歲，平均年齡(51.8±13.3)歲，術后病理診斷低級別膠質瘤(Ⅱ)9例，高級別膠質瘤(Ⅲ、Ⅳ)42例。納入標準：(1)病理證實為膠質瘤；(2)術前行MRI平掃、增強、DWI及IVIM檢查；(3)瘤周水腫區最大徑≥1 cm；(4)適于勾畫足夠感興趣區。排除標準：圖像質量不佳；無法勾畫足夠數目感興趣區。MRI檢查與手術之間的最長間隔為12天。本研究經醫院倫理委員會審批通過，病人知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1.檢查方法：51例病人術前采用 Discover GE 750W 3.T MRI行常規MRI平掃及增強、DWI、IVIM-DWI掃描。病人仰臥位，IVIM及增強定位同平掃橫斷面T1WI序列，掃描范圍從顱頂至枕骨大孔，層厚5 mm，層距1.5 mm。 IVIM參數：TR 6 000 ms，TE 84 ms，10個b值分別為20、50、100、200、400、600、800、1 000、1 500、2 000(s/mm2)，掃描時間9分鐘20秒。

2.圖像處理：將原始圖像傳至AW4.7后處理工作站，采用MADC軟件對數據進行后處理和測量。結合T2 FLAIR和T1增強圖像，由兩名經驗豐富的放射科醫生在R0I區域勾畫IVIM的ROI(大小20～30 mm2),ROI盡量選擇腫瘤實性部分，避開腫瘤內出血、壞死及囊變的區域,同時在對側正常腦白質區放置同樣大小的ROI。依據MRI平掃和增強圖像分別選擇腫瘤強化實質區以及強化病變周圍1 cm內瘤周水腫區為感興趣區，避開血管、囊變壞死及出血區(圖1)。由2名具有5年以上經驗的影像醫師采用盲法將兩個區域分別勾畫5個等大圓形 ROI(大小20～30 mm2)，并計算每個區域ADC、D*、D、f的平均值。

1所示區域為強化瘤體區，呈高信號；2所示區域為無強化瘤周水腫區，呈低信號，瘤周水腫感興趣區勾畫在瘤體區周圍1 cm內

3.免疫組織化學檢查：采用過氧化物酶(S-P)法進行免疫組化染色。使用Olympus微光照相機檢測腫瘤的致密區域，在400倍放大鏡下觀察三個視野。使用Image Proplus5.0軟件分析陽性表達率。Ki-67采用envision法染色。根據染色區密度最高的陽性細胞百分比對腫瘤切片進行回顧和量化；所有具有核染色強度的細胞均視為陽性，Ki-67值定義為陽性細胞占計數總細胞的百分比。

三、統計學方法

表1 腫瘤實體區和瘤周水腫的IVIM參數值

表2 各級膠質瘤IVIM參數的Mann-Whitney-Wilcoxon檢驗

A：膠質瘤瘤體區所有IVIM參數鑒別高低級別膠質瘤的ROC曲線和AUC。B：瘤周水腫區所有IVIM參數鑒別高低級別膠質瘤的ROC曲線和AUC注：ROC：接受者操作特性曲線；AUC：曲線下面積；IVIM：體素內不相干運動；ADC ：表觀擴散系數；D ：純水擴散系數；D* ：假擴散系數；f ：灌注分數

結果

1.IVIM參數在膠質瘤各級別間的差異：Shapiro-Wilk檢驗顯示，瘤體區和瘤周水腫區參數測量值不符合正態分布(P>0.05)。表1為所有參數中位數(下四分位P25，上四分位P75)。表2為Mann-Whitney U檢驗各組間IVIM參數差異結果。在瘤體區，Ⅱ級ADC值高于Ⅲ級、Ⅳ級，低級別膠質瘤高于高級別；Ⅱ級D值高于Ⅳ級，低級別膠質瘤高于高級別；Ⅱ級、Ⅲ級D*值低于Ⅳ級。Ⅱ級f值低于Ⅳ級。瘤周水腫區域，Ⅲ級ADC值高于Ⅳ級；Ⅱ級膠質瘤D值高于Ⅲ級，Ⅲ級膠質瘤D值低于Ⅳ級；D*值各級別間未見明顯差異；Ⅱ級膠質瘤f值低于Ⅳ級； Ⅱ級f值低于Ⅳ級。水腫區諸參數在低、高級別膠質瘤間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.IVIM參數在腫瘤分級中的診斷價值：采用ROC曲線比較各參數的診斷效能。區分低級別和高級別膠質瘤的瘤體區和瘤周水腫區所有參數的曲線及AUC。見圖2。在瘤體區域，ADC、D值及D*表現出較高的AUC、敏感性和特異性(P<0.05)。在瘤周水腫區域，f值顯示出最高的AUC(AUC：0.608)，但差異無統計學意義(P>0.05)。

3.IVIM參數與Ki-67的相關性：免疫組織化學方法檢測了51例膠質瘤中Ki-67指數的表達，使用Spearman相關分析來評估Ki-67值與各參數之間的相關性。各級別間Ki-67差異有統計學意義(P<0.01)，且級別越高，Ki-67指數表達越高。Ki-67與瘤體區的ADC、D、D*參數相關，其中ADC及D值與Ki-67呈負相關，D*值與Ki-67呈正相關，Ki-67與瘤周水腫諸參數及瘤體區f值無顯著相關性。見表3。

表3 腫瘤實體區和瘤周水腫的IVIM參數與Ki-67指數相關性分析

討論

膠質瘤的細胞密度和新生血管灌注情況是膠質瘤分級的重要影響因素，ADC值和D值代表腫瘤細胞密度及水分子自由擴散[3]。本研究中，瘤體區高級別膠質瘤的ADC值及D值較低級別膠質瘤低，與既往研究結果一致[4-6]，提示隨著組織病理級別的增高，腫瘤細胞增殖速度加快，導致細胞密度增大，細胞周圍間隙縮小，水分子的擴散運動受限，ADC及D值在低級別及高級別的鑒別診斷中有較高的敏感度及特異度。D*值表示的是由血液微循環導致的假擴散系數。本研究Ⅳ級膠質瘤D*值高于Ⅱ及Ⅲ級，提示腫瘤級別越高，新生血管越多，微循環灌注成分越高，D*值對高低級別膠質瘤鑒別診斷有統計學意義。f值為灌注分數，是體內微循環灌注效應彌散在總體彌散效應中所占比率，反應腫瘤血容量。理論上，腫瘤級別越高，腫瘤血流灌注容量越大，f值越高。本研究中Ⅳ級膠質瘤較Ⅱ級大，但在其他級別間無明顯差異，對鑒別高低級別膠質瘤無明顯意義，f值與TE存在緊密聯系。根據Takaya 等[7]的研究，計算f值的時候要考慮到T2值差異引起的誤差。劉天助等[8]和Lin等[9]發現，隨著腫瘤級別增高，f值也隨之增大。Lin等[10]的實驗結果顯示，高級別組的f低于低級別組，由于f值易受TE時間、腦脊液和水腫的影響，這可能是本研究中f值在高低級別間無明顯差異的原因。

Ki-67被認為是評估細胞增殖、腫瘤行為、治療反應和預后信息最可靠的方法之一[11]，是評估腫瘤細胞增殖活性的可靠指標Wesseling 等[12]和Chatwin 等[13]研究結果顯示，高低級別膠質瘤之間Ki-67表達存在差異。本研究中，Ki-67指數表達存在差異，級別越高，Ki-67指數表達越高。本研究中，Ki-67與腫瘤瘤體區的ADC、D、D*相關，其中ADC及D值與Ki-67呈負相關，可能是隨著細胞增殖活性增強，細胞排列緊密，水分子彌散受到限制，ADC及D值相應減小。因此，與KI-67呈負相關。D*值與Ki-67呈正相關，腫瘤增殖活躍，微小血管生成增多，D*值增大。IVIM參數與Ki-67相關性表明，IVIM參數可以為膠質瘤實體瘤區域腫瘤細胞增值的評估提供新的指標。

高級別膠質瘤常伴有瘤周水腫，由正常腦組織、血管生成性水腫，混雜少許浸潤的腫瘤細胞組成，也是腫瘤的可能浸潤區。膠質瘤最佳的治療手段是徹底切除腫瘤，特別是切除瘤周水腫區有腫瘤浸潤的部位，影響腫瘤全切除及預后，這在腫瘤位于大腦重要功能區域附近，最大限度地切除包括瘤周水腫區浸潤腫瘤，同時保護腦功能，具有重要的臨床意義[14]。

有研究發現，膠質瘤的級別越高，腫瘤細胞的侵襲性越強，瘤周水腫區的腫瘤細胞越容易遷移[15]。在MRI上對比增強區邊緣外的瘤周水腫區有浸潤性腫瘤細胞[16]。本研究發現，在瘤周水腫區Ⅲ級的ADC值高于Ⅳ級，Ⅱ級膠質瘤D值高于Ⅲ級，腫瘤級別越高，瘤周水腫越明顯，當水腫區浸潤異性細胞所致細胞增生不足以補償血管生成性水腫導致水腫細胞排列疏松，這可能是導致水腫區級別增高ADC值及D值升高的原因。Ⅱ級膠質瘤f值低于Ⅳ級，瘤周水腫區IVIM參數與Ki-67相關性及鑒別高低級別膠質瘤均無統計學意義，瘤周水腫區結構復雜，包括正常腦組織、血管生成性水腫，混雜少許浸潤的腫瘤細胞，膠質瘤特征是復雜性和微觀結構異質性增加，尤其是高級別膠質瘤或高細胞增殖的膠質瘤[17]，比例較小的浸潤細胞導致的細胞密度及灌注差異在IVIM參數表達不足以產生顯著差異，這可能是這項研究中不同級別瘤周水腫區高低級別間參數差異不顯著原因，還可能與我們的樣本量小有關，特別是低級別膠質瘤組例數較少。雖然瘤周水腫區IVIM參數鑒別腫瘤高低級別沒有統計學意義，但在不同級別的差異顯示出可能的潛在的效用。

血管生成是膠質瘤的另一個標志，而致密的血管新生是膠質瘤病理分型的另一個重要標準。根據組織病理學研究，膠質瘤血管計數越高，膠質瘤等級越高。 灌注參數反映了這些血管特性。研究表明，神經膠質瘤細胞在血管周圍積聚并擠壓內皮和血管平滑肌細胞，導致血管失調。在膠質瘤的早期階段，膠質瘤腫瘤細胞穿透現有的血管通道。在膠質瘤的后期，血管生成作為腫瘤細胞侵襲的替代途徑。在以前的研究中，IVIM灌注參數描述了有關膠質瘤血液灌注的信息，包括新血管的形成以及預先存在的動靜脈血管的失調。IVIM灌注參數值f是體素快速擴散部分，也是血流灌注部分的容積分數，即理論上，高級別膠質瘤應該比低級別膠質瘤具有更高的腫瘤血管灌注和更高的f值。 這與本研究一致，其中高級別膠質瘤的部分注射f值顯著高于低級別膠質瘤。 以往的研究表明，高級別和低級別膠質瘤的f值不同，有的高級別的膠質瘤的f值較低級別膠質瘤高，有的則更低。這些相互矛盾的結果可能是由于腫瘤病例的變異性以及IVIM-DWI中回波和TE設置調整有關。IVIM擴散參數D值在診斷高級別膠質瘤和低級別膠質瘤的診斷性能優于ADC值，高級別膠質瘤和低級別膠質瘤的ADC值差異具有統計學意義。我們發現擴散參數的D值在診斷高級別和低級別膠質瘤方面比正常的ADC值更有價值。IVIM注射參數的D*值診斷效率低，這與腫瘤D*圖中的D*值散布較大有關，這可能是由于腫瘤的高度異質性。f值診斷效能一般，這是因為許多因素會影響f值。

本研究有以下不足：(1)回顧性病例選擇及ROI勾畫的主觀性可能影響參數；(2)缺乏瘤周水腫的組織學檢查及新生血管等病理信息；(3)相對較小的樣本量。

綜上所述，瘤體區IVIM有定量反映腦膠質瘤水分子擴散、灌注情況的優點，ADC、D及D*值可作為高、低級別膠質瘤分級的參考依據。雖然瘤周水腫區IVIM參數鑒別腫瘤高低級別沒有統計學意義，但在不同級別間的差異顯示出可能的潛在的效用。IVIM技術尚未常規應用于臨床工作中，其關于膠質瘤診斷及評估方面的價值仍需更多研究支持。