核酸擴增技術在食品快檢中的應用進展

杜 思

（武漢產品質量監督檢驗所，湖北武漢 430000）

食源性病源微生物引起的食物中毒事件時有發生，部分商家對肉類成分摻假讓消費者蒙受損失。因此，如何提高食品病源性微生物檢測、摻假檢測和轉基因成分檢測的速度和效率，是監管部門和食品檢驗員關心的重點問題。

自DNA分子的雙螺旋結構模型被提出，對生物的研究就進入到了分子水平。Kary Mullis提出并發明了聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），使得微量DNA模板在體外大幅增加成為現實。熒光染料和Taq DNA聚合酶的發現使得PCR技術得到了新的發展。為了操作簡便，同時提高檢測特異性和檢測效率，利用不同DNA聚合酶在恒定溫度下反應的等溫核酸擴增技術被提出，現已有環介導等溫擴增反應（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）、滾 環 擴 增（Rolling Circle Amplification，RCA）技術和重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）等多種等溫擴增技術被應用于食品檢測領域。本文就不同核酸擴增技術在食品檢測中的應用進行綜述。

1 變溫核酸擴增技術

變溫核酸擴增技術會經過高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個步驟，一般是指PCR技術及其衍生技術。變溫核酸擴增技術的出現減短了檢測時間，提高了檢測靈敏度和檢測特異性。通過對一般PCR技術的改進和PCR技術結合其他技術，得到了很多新的檢測方法體系，這些檢測方法具有檢測速度更快，檢測精度更高等優點，可區分活死菌和同時檢測多種病原菌等。

1.1 實時熒光定量PCR

Applied Biosystems在1996年提出了實時定量PCR，該技術通過使用熒光染料或者熒光探針對PCR產物進行標記跟蹤，可實時監控反應過程。不飽和DNA雙鏈染料SYBR Green Ⅰ由C.T.Wittwer報道使用，是目前使用最廣的標志性熒光染料。但SYBR Green Ⅰ對PCR反應體系存在一定抑制作用。除了常見的SYBR Green Ⅰ外，邵曉青等[1]發現飽和雙鏈熒光染料LC Green PLUS和EvaGreen，對PCR沒有抑制作用且樣品間定量均一性和異常復孔出現率均優于SYBR Green Ⅰ。包海燕等[2]使用EvaGreen染料建立基于實時熒光定量PCR的蠟樣芽孢桿菌快檢技術，對混檢的8株蠟樣芽孢桿菌全部檢出不受干擾，對人工污染的飼料樣品增菌18～20 h 后，檢測限可達10 CFU/mL。熒光標記探針（TaqMan）是一種雙標記的水解探針，5’末端帶有熒光基團，3’末端帶有猝滅基團，具有高特異性和高靈敏度，且對擴增反應不存在抑制。高正琴[3]建立了TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測空腸彎曲菌辦法，最低檢測限可達4 CFU/mL，且穩定性和重復性良好；應用該方法從78例標本中檢出28例，而普通PCR僅檢出6例。楊瑤等[4]以豬細胞CACA為目的基因，建立了Taq-Man實時熒光定量PCR檢測辦法，可準確檢測豬DNA含量低至0.1%的DNA樣品，豬肉含量低至5.0%（w/w）的肉制品，且相對標準偏差≤25%。魏婉晴等[5]基于實時熒光定量PCR快速檢測試劑盒結合疊氮溴化丙錠對活死菌的選擇性構建了大腸桿菌O157:H7活菌定量檢測技術。結果發現，對菌液稀釋檢測，最低檢測限為84 CFU/mL；將4種常見病原菌基因混檢能夠準確抗干擾檢出大腸桿菌O157:H7；對人工污染樣品檢測可檢測到初始污染量為7.79 CFU/mL。

1.2 微滴數字PCR

微滴PCR被稱為第三代PCR技術，其利用油包水乳液體系將一份檢測樣品分為20 000個納升級微滴，理論狀況下，每個獨立的微滴含有一個或不含待檢樣品目標基因，且每個微滴為一個單獨的PCR反應體系。擴增反應完成后，通過對每個微滴的熒光信號進行分析檢測，統計學分析和陽性微滴比例以絕對定量的方式直接給出靶基因的個數。微滴PCR各個反應體系在相同的反應條件下平行擴增，消除了PCR反應中不同引物和不同產物之間的相互雜交和競爭抑制；不需要建立標準曲線，不依賴擴增曲線的Ct值，不需要內參基因，具有高通量靈敏度高的優點。趙麗青等[6]針對單核細胞增生李斯特氏菌的hlyA基因建立ddPCR檢測方法，檢測限可達90 CFU/mL。對人工污染肉制品檢測，最低可檢出20 CFU/mL單核細胞增生李斯特氏菌。趙新等[7]通過ddPCR技術鑒定轉基因大豆‘GE-J12’的外源基因插入拷貝數，結果顯示外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因組上的插入拷貝數均值為0.99和1.01，此方法體系檢測時間僅需6～8 h，對DNA需求量僅為200 ng。管錦繡等[8]通過優化RT-ddPCR的退火溫度，對稀釋后的GⅡ型諾如病毒RNA進行檢測，檢測靈敏度為5.40 copies/μL，高于RT-qPCR。在對人工污染的西生菜檢測中，RT-ddPCR最低檢測為 54.00 copies/μL，且重復性好。翁文川等[9]通過結合PMA（疊氮溴化丙錠）活細胞熒光染料技術和ddPCR技術，對副溶血性弧菌不同活菌比例的菌液進行檢測，發現PMA-ddPCR可在活菌比例大于1%時測定活菌濃度，檢測靈敏度為2 CFU/mL；在對人工污染的樣品檢測時，污染樣品基圍蝦檢測靈敏度為1.12×101CFU/g，污染樣品帆立貝檢測靈敏度為 8.96 CFU/g，均低于PMA-qPCR檢測限，在低濃度污染量樣品的檢測中具有更大優勢。

2 等溫擴增技術

等溫擴增技術反應過程始終維持在恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物達到快速擴增核酸的目的。等溫擴增技術具有快速、高效、特異性強的優點，同時不需要專用的設備，且操作簡單，適用于對檢測速度要求高的檢測場合，同時對于基礎薄弱的基層檢測部門具有易普及的優點。常見的等溫擴增技術有滾環擴增技術（RCA）、環介導等溫核酸擴增（LMAP）、重組聚合酶擴增反應（RPA）以及交叉引物擴增技術（Cross Priming Amplification，CPA）等。相比變溫技術PCR，等溫擴增技術由于其運用的酶的多樣性，各個技術的擴增原理千差萬別，不同技術使用的最佳反應溫度各不相同。

2.1 環介導等溫核酸擴增

環介導等溫擴增技術是由Notomi等開發提出，恒定的溫度（61～65 ℃）下，在具有高鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）作用下，進行DNA合成反應。LAMP技術針對靶基因上的6個特異性區域設計6對引物：正向內引物、反向內引物和外引物。相比于普通PCR兩對引物，特異性極高，且反應溫度恒定僅需要一個水浴鍋即可完成。在反應進行時，DNA不斷合成，生成大量白色的焦磷酸鎂沉淀，因此通過肉眼觀察白色沉淀是否產生即可判斷擴增與否，不需要煩瑣的電泳和紫外觀察；或者在反應產物中混入熒光染料（SYBR Green Ⅰ），擴增發生則反應體系為綠色，未發生則為橙色。胡仲皓等[10]針對單核細胞增生李斯特氏菌的保守基因actA設計引物，利用熒光染料（SYBR Green Ⅰ）作為反應指示劑，對多種病原菌混檢，僅檢出單核細胞增生李斯特氏菌，檢測下限為4.7×101CFU/mL。王冠蕾[11]利用PMA抑制死菌DNA擴增的特點，結合PMA和LAMP技術，向反應體系中加入羥基萘酚藍（HNB）對嬰兒配方奶粉中的沙門氏菌活菌進行可視化快檢，結果表明對純培養物稀釋檢測靈敏度為4.6×101CFU/mL，對人工污染樣品的檢測靈敏度為6.3×101CFU/mL，且檢測時間不超過90 min。

2.2 重組酶聚合酶擴增（RPA）

重組酶聚合酶擴增技術在37 ℃下，5～20 min即可完成檢測，具有特異性強、靈敏度高、操作簡單等優點，甚至可以直接利用人的體溫進行檢測，適用于現場檢測。此技術模仿T4噬菌體內的核酸復制機制，依賴重組酶uvsX和單鏈結合蛋白Gp32在體外恒溫條件下即可實現DNA模板的特異性識別和結合，再通過鏈置換DNA聚合酶Bsu實現模板DNA的擴增。周樹青等[12]利用RPA檢測試劑盒建立GⅡ型諾如病毒快速檢測體系。對不同諾如病毒、星狀病毒、MS2噬菌體、人輪狀病毒和人腺病毒基因組混檢，結果表明該方法特異性良好且檢測下限為106 copies/μL，對人工污染陽性樣品進行檢測，均可檢出且穩定性良好。吳華華等[13]針對金黃色葡萄球菌的nuc基因的保守序列，設計RPA特異性引物，可在37 ℃孵育35 min檢測金黃色葡萄球菌，特異性極強，該方法對金黃色葡萄球菌的純培養物和人工污染樣品的最低檢出限均為10 CFU/mL。謝實龍等[14]利用RPA技術對轉基因大豆MON 89788建立了實時熒光RPA檢測體系，該方法絕對檢測限可達40拷貝，相對檢測限為0.05%，在39 ℃下僅需10 min可完成對實際樣品的檢測。

3 結語

食品安全問題受到人們的關注，因此對食品安全檢測的要求也在不斷提高。核酸擴增技術發展日新月異，不同技術具有不同的特點。除了本文提到的核酸擴增技術外，核酸擴增技術和其他技術的結合有以下幾種。例如，免疫捕獲PCR可適用于病原菌的富集和分離，以減少前增菌的時間進一步縮短檢測時間；報告噬菌體法改造噬菌體結合報告基因，改造后的噬菌體侵入細菌釋放DNA，檢測過程可以區分活死菌。隨著分子生物學技術的不斷發展，食品快檢技術也會隨之更新完善，對食品的檢測會變得更加快速、便捷和準確。