淺析酶抑制法在農藥殘留檢測中的應用及酶源的研究進展

趙素娟，包 琴，趙麗杰

（1.四川省輕工業研究設計院有限公司，四川成都 610084；2.西安市糧油質量檢驗中心，陜西西安 710000）

1 農藥殘留及其危害

我國一直以來都是以農業為主導的國家，在全球化的推動下，大量的農產品開始向海外輸出。作為一個農業大國和出口大國，我國在食品安全和農產品安全方面的問題日益突出。在農業現代化的發展過程中，農藥在維持高效的農業生產力方面發揮著重要作用。因此，廣泛使用農藥管理生產是高投入集約化農業生產系統的主要特征[1]。科學合理使用農藥能達到對農產品的防病、防蟲害效果，同時也能保證穩定生產農產品，有效增加產品產量和避免巨大的農業經濟損失[2-4]；但不合理投入使用農藥會對農產品造成污染，農藥會殘留在作物表面（莖、葉、果實和根等部位）。如今，人們的消費能力不斷增強，食品安全問題也多次敲響警鐘，人們越來越關注農藥殘留帶來的危害，如HADIAN 等[5]分析了不同化學結構的48 種農藥殘留物包括有機氯、有機磷、有機氮和擬除蟲菊酯等其他化學基團在水果和蔬菜中的農藥殘留情況；DIOPA 等[6]對達克爾地區的農藥殘留現狀進行了分析檢測，多份樣品被檢出農藥殘留，從檢出率結果可以得出，應指導種植者合理使用農藥，并嚴控農藥的使用量。為保障人們的身體健康，也應重視對農藥殘留量的檢測以及其檢測技術的開發與研究。

2 農藥殘留檢測方法

目前，市場對農產品農藥殘留量的檢測提出了更多的要求，使用快速、有效、方便和低成本的手段得出結果的農藥殘留檢測技術逐漸符合我國目前的市場要求。已知的農藥殘留檢測方法有多種，目前使用較多的方法大致分為經典方法與快檢方法。經典方法能夠定性、定量分析樣品中農藥殘留量，一般需使用大型的精密儀器才能有效檢測樣品，主要包括色譜法（氣相色譜法、液相色譜法）[7-10]、色譜與質譜聯用法[11]，分析范圍廣，能對樣品進行多通道分析，也有利于樣品的多種農藥殘留組分分析，具有儀器靈敏度高、檢測限低等特點。經典法是目前使用較多也是較為成熟的檢測方法，在環境、生物、化學和藥學等領域都有深入的應用。經典儀器法對檢測人員的技術要求高，對樣品的前處理要求嚴格，儀器使用前后的設備維護成本高，且檢測樣品農藥殘留所需時間長，其更適合監督檢測部門使用而不適宜基層部門在市場中對快銷農產品進行農藥殘留檢測。快檢方法可實時實地快速檢測產品是否合格，其配套儀器簡單、耗材成本低，對檢測人員技術要求低，在農貿市場、農產品生產地、果蔬銷售門店、超市和家庭等地方都能進行檢測，常用的快檢方法有酶聯免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[12]、生物傳感器法[13]、酶抑制法[14-15]等。

3 酶抑制法

酶抑制法在農藥殘留檢測中的應用是在1951 年提出的，其應用廣泛也較早。酶抑制法的主要檢測原理是有機磷類、氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶與羧酸酯酶等有很強的抑制力，能進一步影響酯酶酶促反應中酶與底物的反應過程，從而影響底物與顯色劑的反應，這種顯色反應可在生物體外反映出農藥的抑制力[16-17]。在整個反應過程中，可觀察到酶促反應體系會產生一定的顏色變化，或酶與某些特定化合物結合后其理化信號強弱會發生變化，從而判定樣品中是否含有農藥以及農藥殘留量是否超標。一般情況下，在體外的實驗檢測中，農藥的添加會使檢測用酶的酶活受到一定的影響，當提高農藥的添加量時，所用酶的酶活性會減小，酶對底物水解后生成的底物累積量與酶活性成正相關，酶活力越大，產物就越多。近年來，市場上使用的農藥殘留檢測技術、農藥殘留檢測設備大多是基于酶抑制法的原理設計。目前市場上已研制出多種基于酶抑制法原理的農藥殘留快速檢測試劑盒，且國外多個國家也將這類試劑盒作為在田間進行初步篩查農藥殘留量的主要手段。酶抑制法具有方法簡單易于操作、成本低、檢測用時短、可行性高和樣品檢測量大等特點，大部分方法對樣品的要求不高，簡單處理后即可檢測，適合基層執法人員、家庭及個人使用。酶抑制法目前是市場使用最廣泛的方法，國內也出臺了多個標準指導其使用，如GB/T 18625—2002、GB/T 18626—2002、GB/T 18630—2002 等。因此，酶抑制法是農藥殘留快檢技術中一種非常重要的檢測方法。

4 酶抑制法快檢方法

4.1 分光光度法（比色法）

分光光度法的檢測原理為提取的樣品溶液與酶液反應一段時間后，加入底物與顯色劑，在有機磷類農藥或氨基甲酸酯類農藥的作用下，檢測酶液的酶活會受到抑制從而影響酶促反應，再利用配套的儀器設備比色分析，判斷樣品溶液中的農藥殘留含量是否超標[18-19]。此類基于酶抑制法的快速檢測方法由于其技術要求不高，使用人員經簡單培訓后即可掌握，因此該方法也是我國使用最多的方法，在市場中受到基層執法人員的歡迎。

4.2 試紙法

預先將酶與底物或與底物類似的物質經處理后固定在濾紙片上，檢測時將待測樣品溶液置于固定化后的紙片上，通過目測紙片上的顏色深淺再對比分析，從而判定樣品農藥殘留含量情況。常用的底物為靛酚乙酸酯，當酯酶與靛酚乙酸酯發生酶促反應后，會生成藍色的靛酚與乙酸物質，靛酚在紙片上會顯現出藍色，樣品農藥殘留含量越高在紙片上顯現的藍色會越淺，經過測試后的紙片一般會出現藍色、淺藍色、白色這幾種層次的顏色。該方法用時短、成本低，常用于果蔬農藥殘留快檢[20]。

4.3 酶傳感器法

生物敏感器件與傳感器相結合時，可用于分析一些特定的化學物質。生物敏感器件的主要作用是與待檢化合物發生物理化學反應，傳感器是將這種反應轉換放大為一種可記錄與分析的信號。利用這一特點，可研制出能用于檢測農藥殘留的酶傳感器從而應用于快檢市場中[21]。此類基于酶抑制法的酶傳感器的響應值大小一般是由酶與底物相互作用的效果決定的，因此該方法對酶活和底物的要求較高，底物在反應中具有重要作用，要拓展傳感器的使用，選擇合適的底物是一個重要標準。AChE 和BChE 這兩類酶催化水解產生的特異性底物乙酰膽堿鹽和丁酰膽堿鹽是電位檢測的優先選擇底物。生物傳感器的使用效果一般用酶負載量、pH 值范圍、靈敏度和重復性等因素來表示，因此在開發研制酶傳感器的過程中，確定這些參數的最優值非常關鍵。

5 酶抑制法酶源

酶抑制法檢測有機磷類、氨基甲酸酯類等農藥的敏感性與酶、底物、顯色劑、反應溫度、時間和pH等因素有關，酶是影響該檢測技術靈敏度、可行性、可靠性和準確性的關鍵因素[22]。目前，國內對酶抑制法酶源的研究主要是動物酶源和植物酶源。動物酶源中提取的酯酶為乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。乙酰膽堿酯酶是從動物的紅細胞或神經組織中分離出的，目前對它的研究最具影響力的是從美洲蟑螂的大腦中提取的酯酶。丁酰膽堿酯酶的主要來源為動物血清和肝臟，其中最具代表性的是從雞血清中提取的酯酶[23]。

目前，針對我國使用的有機磷、氨基甲酸酯類農藥，以乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶作為酶抑制法的酶源最為適宜，但乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶主要來自動物體內，且價格昂貴，不易長時間保存，遠達不到我國農藥快速檢測的需要。植物酯酶由于來源廣泛、取材方便、成本低以及制備簡單，已引起眾多學者的廣泛關注。近年來，有關植物酯酶對農藥的敏感性的研究表明，其對農藥檢測的靈敏度不亞于動物酯酶，部分植物酯酶甚至比動物酯酶更敏感[24]。針對目前我國存在的農藥殘留問題，迫切需要開發一種通用、行之有效的農藥殘留量檢測技術，以促進農藥殘留的快速測定。因此，資源豐富、價格低廉的植物酯酶成為人們的首選[25]。