植物源性食品中真菌毒素檢測方法的研究進展

趙飛

遼寧省檢驗檢測認證中心（沈陽 110000）

真菌毒素是真菌產生的有毒天然代謝產物[1]。食品中真菌毒素的存在是全球關注的問題，據聯合國糧食與農業組織（FAO）統計，每年全球糧食有25%受到真菌毒素的污染[2]，糧食以外的多種植物源性食品也易受真菌毒素的污染，如植物油、堅果與籽類食品等。被污染的植物源性食品通過食物鏈進入人體和動物體內，這些真菌毒素會被代謝成毒性更強的次級代謝物，導致人體健康的風險增大[3]。國內外主要植物源性食品中主要被污染的真菌毒素種類為黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）[4]。這些真菌毒素可通過抑制體內蛋白質和相關酶的合成，損害肝、腎、神經等組織，具有致癌、致畸、致突變等作用[5]。隨著對真菌毒素的研究與認識的不斷深入，國內外100多個國家制定食品和飼料中真菌毒素的限量標準要求[3]，隨之真菌毒素的檢測方法也在不斷更新，對此研究也越來越多。為了提升對植物源性食品中真菌毒素的認識與檢測方法的選擇和開發，本文從植物源性食品中真菌毒素概述、前處理方法、檢測方法三方面進行了介紹，并展望了未來植物源性食品中真菌毒素未來的發展趨勢。

1 植物源性食品中真菌毒素概述

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergilus flavu）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）在合適的環境條件下，經聚酮途徑所產生的一組有毒次生代謝產物，該類毒素的結構含有1個二呋喃環與1個氧雜萘鄰酮[6]，是自然界已知的化合物中理化性質最穩定的一類真菌毒素，具有強毒性[7]，對許多肝臟等器官具有嚴重的毒害作用，還會引發生殖能力減退、出血性貧血等[8]。研究發現的黃曲霉毒素有20多種，已分離鑒定的黃曲霉毒素有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2等18種，其中黃曲霉毒素B1的毒性和致癌性是已知該類毒素中最強的[9]。該類毒素主要污染的植物源性食品有小麥、玉米、大豆、花生等產品[10]。

1.2 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮，又稱F-2毒素，是一種2, 4-二羥基苯甲酸內酯類化合物。它是由鐮刀菌屬真菌產生的一種次級代謝產物，類雌激素真菌毒素[11]。玉米赤霉烯酮主要通過抑制動物器官的發育，來影響動物的生殖系統功能，具有較強的生殖毒性[12]。它的結構與內源性雌激素類似，可作用于動物的卵巢，引起動物體內雌性激素水平的升高，導致雌激素亢進癥[13]。玉米赤霉烯酮除了會產生生殖毒性外，還會損傷動物的免疫系統、內分泌系統，造成動物的免疫力下降、肝腎功能紊亂等[14]。玉米赤霉烯酮易污染玉米、小麥等谷物，尤其是當這些谷物儲存不當時更易被污染[15]。而這些被玉米赤霉烯酮污染的谷物，通過食物鏈不僅會對動物如蛋雞的產蛋量等產業造成較大的經濟效益影響，還會對人體健康產生很大威脅[12]。

1.3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，因感染該毒素的人或動物常出現嘔吐現象，因此又稱為嘔吐毒素[16]。它是一種主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）在適宜的氣溫和濕度等條件下繁殖并產生的次級代謝產物，對動物和人體均有一定的毒性。世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）、歐盟分類標準中，均將其列在3類致癌清單中[17]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇具有細胞毒性、遺傳毒性、急性毒性、免疫毒性作用，對動物和人類均會造成較大傷害[18]。通過脫氧雪腐鐮刀菌烯醇慢性毒性試驗發現，攝入脫氧雪腐鐮刀菌烯醇會導致肝癌的發生[19]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇主要污染小麥、大麥、玉米、黑麥和燕麥等谷類植物源性食品[20]，是全球谷物污染率較高的真菌毒素，且較難做到根本防治[21]。

1.4 赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素A由青霉（penicillium）和曲霉（aspergillus）產生，它是赭曲霉毒素中毒性最大的一種真菌毒素，可引起免疫抑制，IARC將其列為2B類致癌物[22]。動物和人類食用被赭曲霉毒素A污染的食物，會對肝腎造成損害，食用量較大時，會發生中毒、癌變。赭曲霉毒素A主要污染糧谷類、堅果等植物源性食品。

2 植物源性食品中真菌毒素的前處理方法

植物源性食品基質組成成分復雜多樣，且真菌毒素的限量水平較低。采用儀器檢測時，基質成分對待測真菌毒素具有一定的基質效應，為達到更高的方法靈敏度，對該類食品進行一定的前處理非常必要。真菌毒素的前處理方法主要有液相萃取法、固相萃取法和輔助提取法。

2.1 液相萃取法

液相萃取法，是目前食品安全國家標準中使用最廣泛的一種，較其他方法更為成熟。提取溶劑通常以甲醇、乙腈等有機溶劑，以及不同比例的有機溶劑水溶液為主。該法具有操作簡單快速、設備簡單、普適性好、成本低廉等優點。該法已用于谷物等多種植物源性食品中赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮等多種真菌毒素的前處理中。但該方法中有機溶劑用量較大，不利于實驗人員身體健康，也不利于環境保護[23]。

2.2 固相萃取法

固相萃取法，是將樣品提取液與合適的固體吸附材料相互作用，使待測的真菌毒素與基質中其他成分分離的方法。固相萃取法關鍵是選擇合適的固相吸附材料，需要綜合考慮待測成分性質、基質組成情況、各種固體吸附材料的適用范圍等。固相萃取材料除傳統使用的C18等，后續還研發了磁性納米材料等。固相萃取法一般步驟為活化、上樣、淋洗和洗脫。該過程對待測真菌毒素具有較高的富集率，并通過固相吸附材料對于提取液中各種成分有一定的選擇性，且一般有機溶劑的使用量較少，是目前植物源性食品中真菌毒素分析的常用樣品前處理方法。何曉明等[24]以聚多巴胺@磁性石墨烯納米材料（PDA@Fe3O4-G）為新型吸附劑的磁固相萃取技術，建立植物油中8種真菌毒素的分析方法，該法操作簡便，前處理高效，更利于環境保護。但該法所使用的固相萃取柱一般不可重復使用，以至于試驗成本較高。

2.3 輔助提取法

輔助提取法，是借助外力的作用加快待測成分從樣品基質轉移至提取溶劑中的方法。這種方法用于植物源性食品中真菌毒素的檢測時，可以促使真菌毒素分子更快、更高效地從樣品基質中提取出來，如超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等。通過外力的作用提高提取效率，縮短提取時間，并通過條件設置在一定程度上起到去除雜質、濃縮等效果。該方法萃取時間更短，溶劑消耗更少，檢出限更低[23]。但該類提取法一般需要配備專用的輔助提取設備，尚未成為食品中真菌毒素的標準檢測前處理方法。

3 檢測方法

植物源性食品中真菌毒素的檢測方法主要有液相色譜-質譜法、液相色譜法、酶聯免疫吸附測定法和薄層色譜法。

3.1 液相色譜-質譜法

液相色譜-質譜法是將液相色譜分離與質譜檢測相結合，具有高效分離、高選擇性、高靈敏度、高特異性等優勢。隨著質譜檢測技術的高速發展，液相色譜-質譜法在真菌毒素的定性分析、定量分析和非定向篩查檢測中得到廣泛的應用。在黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素M1的食品安全國家標準中，均采用液相色譜-質譜法。同時，采用液相色譜-高分辨質譜法進行植物源性食品中真菌毒素的篩查研究已有報道。賈瑋等[25]采用超高效液相色譜-四極桿串聯靜電場軌道離子阱質譜儀，采集38種真菌毒素標準物質的色譜信息、分子離子和二級碎裂片段，建立38種真菌毒素標準數據庫，并對裂解途徑進行解析，對每種真菌毒素的特征碎裂片段進行篩選，構建乳制品中真菌毒素的非定向篩查方法。但液相色譜-質譜法對于實驗室環境、實驗操作人員等的要求較高，而且儀器的運行成本也較高。

3.2 液相色譜法

液相色譜法是以液體作為流動相的色譜法。樣品溶液經進樣器引入色譜柱中，樣品溶液中的各組分通過不同類型的色譜柱進行分離，再經過檢測器進行檢測。液相色譜法的適用范圍非常廣，對樣品的要求較液相色譜-質譜法相對寬松。采用的檢測器主要有紫外檢測器、熒光檢測器和二極管陣列檢測器。該方法已被廣泛應用到植物源性食品中真菌毒素的檢測中，但同時檢測多種真菌毒素的能力與液相色譜-質譜法相比要差一些。

3.3 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定法是將已知的抗原或抗體作為固相載體，使用標記的酶與底物進行反應而發生顯色，通過顯色反應來判斷是否發生了免疫反應。酶聯免疫吸附測定法具有反應特異性強、檢測準確、穩定高、靈敏度高、樣品前處理簡便、檢測成本低等優勢，是常用的快速檢測植物源性食品中真菌毒素的方法。但該方法對實驗人員的要求較高，需要經過專業培訓，同時實驗室需要配備酶標儀，該方法的檢測時間較長，不適用現場的快速檢測工作。

3.4 薄層色譜法

薄層色譜法是色譜法中較早的經典分離方法。該方法中樣品溶液通過點樣器固定在固定相上，通過展開劑、固定相與樣品溶液中各種組分相互間的作用，各組分在薄層板上展開，通過與標準物質溶液的比值進行定性分析，通過光學檢測法、物理顯色法等方法進行定量。該方法對樣品前處理效果要求相對較低，操作人員一般無需經過專門培訓，也無需使用特殊的儀器，對實驗室環境要求較低，實驗成本低廉，可控。同時，薄層色譜法對固定相和展開劑的選擇自由度相對較大。

4 結語與展望

重點介紹植物源性食品中較易污染的真菌毒素情況，并對近5年植物源性食品中真菌毒素的主要前處理方法和檢測技術研究進展進行論述，分析這些方法和技術對真菌毒素檢測的優缺點。植物源性食品中真菌毒素的檢測研究中存在的困難主要有：一是植物源性食品的種類較多、基質組成復雜，建立普適性的檢測方法較為困難；二是植物源性食品中真菌毒素的含量水平往往較低，對于檢測方法的選擇性和靈敏度要求較高；三是同一種類植物源性食品可以同時被多種真菌毒素污染，需要建立同一類食品中多種真菌毒素的同時檢測方法；四是在日常的工作和生產活動中，對于植物源性食品中真菌毒素的檢測速度要求較高，如大米的集中采購等，因此需要開發植物源性食品中真菌毒素的快速檢測方法；五是當前植物源性食品中真菌毒素的檢測方法中，試劑用量較大，不利于環境保護與綠色發展，需要開發綠色環保的檢測方法。因此，開發普適性、高靈敏度、高選擇性、高通量、快速環保、成本低廉的檢測方法，依然是植物源性食品中真菌毒素分析的重要研究方向。同時基于真菌毒素的光譜特性等，研究實時無損的檢測方法也是未來真菌毒素監測的發展趨勢，以滿足實際工作和生產活動的需求。